摘要
背景与目的： 顺铂作为第一代铂类药物，目前仍是临床非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)化疗方案中不可或缺的化疗药物，但是其较大的副作用以及多重耐药的产生严重限制了其临床抗肿瘤疗效。以纳米材料为载体实现顺铂的体内运输是解决这一问题的重要途径，然而纳米药物的体内可降解性、组织渗透性、释药的可控性以及诊疗评估的可视化与精准化等问题是其实现临床转化过程中的主要障碍。因此，本研究在靶向分子RGD上连接穿模肽R8，确保纳米载体主动靶向能力的同时提高其组织穿透性；装载MRI对比剂Fe3O4以实现生物分布的可视化；同时以近红外触发光热效应下SiO2纳米载体的液气相变设计，以实现药物的可控性释放并进一步增强其组织渗透性及体内可降解性；最终合成R8-RGD靶向的光致相变型纳米诊疗一体化载药体系PFe-PFH@SiO2-PANI，通过体外细胞学实验、定量MR功能成像技术介导下的活体成像和疗效评估的动态监测实验以及病理免疫组织化学分析方法，从分子、细胞及动物模型等多个水平深入探讨该多功能纳米载药体系对NSCLC的抗肿瘤疗效及作用机制，为NSCLC的一体化诊疗研究提供新的理论基础及临床思路。 方法： 1.纳米体系的构建：应用透射电镜、纳米粒度仪、拉曼光谱仪、X射线光电子能谱仪、振动样品磁强计以及电感耦合等离子体质谱等方法对合成纳米粒子的形貌、粒径、结构、磁性以及载药量进行表征与分析；同时应用可见-近红外分光光度计记录纳米溶液温度变化并分析其光热转换效率；最后应用透射电镜对纳米粒子近红外触控下的液气相变及药物释放进行评价。 2.体外细胞实验：应用MTT法、细胞吸收实验、流式细胞计量分析及细胞ROS水平检测等方法研究近红外触控下PFe-PFH@SiO2-PANI纳米体系对人非小细胞肺癌(A549)的抗肿瘤效果及作用机制。 3.体外及活体成像：应用1.5T医用磁共振扫描仪对PFe-PFH@SiO2-PANI纳米体系溶液的T2弛豫效率进行测定；构建A549皮下移植瘤动物模型，应用T2mapping及R2*mapping两种定量MRI成像方法对尾静脉注射药物前后不同时间点PFe-PFH@SiO2-PANI纳米粒子及Fe3O4的活体分布进行实时、定量监测以进一步评价其活体成像能力及肿瘤内分布特征；应用普鲁士蓝染色对荷瘤小鼠给药后72h的心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤内PFe-PFH@SiO2-PANI纳米粒子及Fe3O4的含量进行定性评价。 4.活体疗效评估：应用DWI-MRI对荷瘤小鼠给药前及给药后3d、7d、14d、21d的肿瘤组织的细胞活性进行定量分析，结合形态学数据、血液指标、病理及免疫组化分析等方法，对PFe-PFH@SiO2-PANI纳米体系的活体内抗肿瘤疗效及安全性进行综合评估。 结果： 1.PFe-PFH@SiO2-PANI平均粒径是202nm，电镜下呈分散性好、大小均一的圆球纳米体系，具备典型的顺磁性特征。同时该纳米体系具有良好的近红外响应性释放性能以及光热转换效率，可以在短时间内使纳米体系破裂并释放药物。 2.随着时间的延长，纳米药物PFe-PFH@SiO2-PANI进入细胞的量逐渐增多。单独的纳米体系并不影响肿瘤细胞的生长，而当有近红外光照射的情况下，肿瘤细胞存活率明显下降，并且细胞内活性氧水平明显上升。 3.相较于Fe3O4(r2=85.03mM-1s-1)，PFe-PFH@SiO2-PANI在体外实验中表现出了更加良好的T2弛豫衰减能力(r2=258.5mM-1s-1)；活体成像实验结果显示，PFe-PFH@SiO2-PANI纳米组肿瘤组织给药前后的T2值及R2*值均在12h时间点达到极值状态，且与Fe3O4组间具有明显的统计学差异(P=0.005、0.001)；用药后72h的普鲁士蓝染色结果显示，Fe3O4在肝脾组织、心脏、肺及双肾中均可见不同程度的聚集，以脾脏最为显著；而PFe-PFH@SiO2-PANI则在各个脏器均未见明显聚集。 4.近红外触控下PFe-PFH@SiO2-PANI治疗组，在给药3天后即可发生明显的肿瘤生长抑制，ADC值相较于对照组明显升高，随后肿瘤继续缩小，ADC值进一步升高，并明显高于同一时间点的近红外触控下Fe-PFH@SiO2-PANI热疗组及单纯顺铂化疗组。免疫组化结果显示，近红外触控下PFe-PFH@SiO2-PANI治疗组的Ki67及VEGF水平均显著低于其他各组。同时，相较于单纯顺铂组荷瘤小鼠体重的逐渐减低，近红外触控下PFe-PFH@SiO2-PANI治疗组小鼠的体重未见明显异常改变；血液学指标显示，单纯顺铂组中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、乳酸脱氢酶(LDH)以及肌酸激酶(CK)水平均显著高于其他各组，而近红外触控下PFe-PFH@SiO2-PANI治疗组各指标未见明显异常。 结论： 本研究成功构建了一种可用于NSCLC诊疗一体化的R8-RGD靶向的光致相变型纳米载药体系PFe-PFH@SiO2-PANI。该体系具备良好的近红外响应释放性能以及光热转换效率，在体外及活体内均具有显著的T2弛豫性能并可用于MRI-T2WI阴性对比成像；在MRI对PFe-PFH@SiO2-PANI纳米体系活体分布定量可视化的介导下，通过体外近红外触控的方式成功实现了药物的可控性释放并在分子、细胞、及形态学水平验证了其良好的抗肿瘤疗效，同时显著降低了单纯顺铂治疗对机体的副作用损害，为NSCLC的一体化诊疗研究提供了一种新的理论基础以及可行的解决策略。
NETL