摘要
目的: 酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是最常见的肝脏疾病之一。近年来，罹患ALD的数量和比例都在不断上升，但相应的治疗方案仍处在探索阶段。因此预防和治疗ALD备受关注。目前多数学者从肠肝轴角度研究ALD的发病机制，认为氧化应激损伤和肠源性脂多糖(LPS)渗漏是关键环节。首先，大部分酒精直接进入肝细胞代谢，打破氧化还原平衡，引起氧化应激和脂肪变性，对肝脏造成主要损伤，是ALD的核心发病机制;其次，少量酒精滞留于肠道，扰乱肠道菌群稳定，破坏肠道屏障，致使肠源性LPS渗漏引发肝细胞炎症反应，加重氧化应激，形成了“二次打击”。 中药具有靶点多，疗效好且副作用少的特点，因此使用中药防治ALD日益受到国内外科研者的关注。广藿香为唇形科植物广藿香(Pogostemon cablin (Blanco)Benth.)的干燥地上部分，具有芳香化浊、发表解暑和开胃止呕的功效。课题组前期研究表明，广藿香的主要有效部位广藿香油(patchouli oil，PO)通过抑制氧化应激减轻急性酒精性肝损伤，广藿香醇(patchouli alcohol，PA)作为广藿香油的主要成分，并具有良好的抗氧化作用，可能同样能通过此环节减轻酒精对肝脏的急性损伤;同时PA还能够调节肠道菌群，保护肠道屏障功能，具有良好的抗炎效果，因此，我们推测PA可能也通过肠肝轴机制减轻酒精造成的急性肝损伤。本研究拟基于酒精对肝脏的造成的“二次打击”机制，探讨PA对急性酒精性肝损伤的保护作用，阐明广藿香抗酒精性肝损伤的物质基础和作用机制。 方法: 70只健康雄性Wistar大鼠随机分为7组:正常组(NC)，模型组(Model)，阳性药物水飞蓟素组(200mg/kg，Sily)，广藿香油组(400mg/kg，PO)，广藿香醇低、中、高三个剂量组(10、20和40mg/kg，PA)，每组10只。除NC组和Model组灌胃给予生理盐水外，其余各组大鼠预先灌胃给药7天，第8天开始Model组和给药组每隔12h灌胃给予65％的乙醇(10ml/kg)，灌胃6次以构建ALD模型，灌胃酒精的同时每天依旧给予药物治疗。末次造模给药12h后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，离心获得血清，用生化定量法测定血清中ALT和AST的活性;收集肠道内容物，抽提肠道菌群DNA，应用Illumina测序分析平台进行测序，进行物种丰度分析和多样性分析等;剖取相同部位的肝和结肠组织于多聚甲醛固定，H&E染色评价肝组织和结肠组织病理结构变化;运用ELISA技术分析肝组织ROS、LPS、LBP、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平;生化定量法分析肝组织GR、GSH、GSH/GSSG、SOD和CAT的含量;采用Western-blot技术分别检测肝组织CYP2E1、Nrf2、HO-1、TLR4、p-NF-κBp65、NF-κBp65、IκBα、p-IκBα、CD14、MD2、MyD88的蛋白表达和肠组织Z0-1、occludin的蛋白表达，进一步探讨PA对酒精所致的急性肝损伤的保护作用机制。 结果: 与NC组相比，Model组大鼠血清中肝功能指标ALT和AST水平显著上升;HE染色分析发现Model组肝组织中出现大面积坏死、炎性浸润和微泡脂肪变性。而Sily、PO和PA均能显著降低血清中ALT和AST水平，并且减少肝脏组织中出现坏死面积、炎性浸润和脂肪变性，恢复肝细胞形态结构完整。其中，PA高剂量效果最优，与NC组水平相当。 与NC组相比，Model组大鼠肝细胞中抗氧化酶类CAT、SOD、GSH、GR、GSH/GSSG的水平显著降低，ROS含量增加，CYP2E1蛋白的表达增强和Nrf2/HO-1蛋白的表达受抑制。而PA能明显提高上述抗氧化酶类的水平，减少ROS堆积，下调CYP2E1蛋白表达并激活Nrf2/HO-1信号通路来缓解酒精引起的氧化应激，减轻酒精对肝脏的主要损伤。 与NC组相比，Model组大鼠肠道中条件致病菌比例显著增加，益生菌比例减少，肠屏障紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达减弱，血清中LPS含量增加，LPS相关受体蛋白(LBP、CD14、MD2)的表达增强，TLR4/NF-κB通路被激活及下游炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)被大量释放，证明肠源性LPS渗漏已造成肝细胞炎症应答。而PA还可维持肠道菌群稳定，显著抑制致病菌的繁殖和促进益生菌的生长，并能上调肠屏障occludin和ZO-1蛋白的表达维持肠屏障粘膜稳定性，降低其通透性以减少肠源性LPS渗漏入血对肝脏形成“二次打击”。PA能抑制上述LPS相关受体蛋白的表达和TLR4/NF-κB信号转导通路的激活，减少炎性因子的合成与释放，从而减轻肝脏遭受“二次打击”后发生的炎症反应。 结论: PA具有较好的抗急性酒精性肝损伤的作用，是治疗急性酒精性肝损伤的潜在先导化合物。其作用机制可能是通过缓解氧化应激减轻酒精对肝脏的主要损伤，并通过调节肠道菌群、减少肠源性LPS释放入血、抑制TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应减轻LPS对肝脏的“二次打击”。
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