摘要
长期能量摄入超过能量消耗带来的能量不平衡将导致肥胖等代谢性疾病的发生。脂肪组织是人体内重要的内分泌器官，分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪。其中，白色脂肪根据机体能量需要存储和释放能量，而棕色和米色脂肪则通过解耦联作用产生热量从而消耗多余能量。近年来成人体内棕色和米色脂肪的重新发现以及对棕色和米色脂肪功能的深入研究，使得通过激活棕色/米色脂肪促进能量消耗成为治疗肥胖等代谢性疾病的潜在策略。文献报道表明棕色和米色脂肪可以被一些内源性因子、激素和代谢产物甚至是小分子化合物所诱导形成或激发产热活性，可以有效地减轻体重并改善糖脂代谢异常。由于这些研究大多是在动物模型上进行，其在临床上的应用由于种属差异性和安全性等原因受到限制。目前鲜有药物报道能安全有效地促进人体棕色或米色脂肪活性。小檗碱(Berberine，BBR)是一种从小檗属植物中提取出来的传统药用生物碱，作为抗菌药在临床上应用广泛。小檗碱在免疫性疾病、心血管疾病、2型糖尿病、肿瘤和神经退行性疾病等方面具有良好的药理活性。研究表明，小檗碱可以提高脂肪产热活性，促进2型糖尿病和肥胖动物模型db/db小鼠能量代谢并降低体重。对2型糖尿病患者和非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者的两项临床实验发现，BBR慢性干预可降低体重和身体质量指数(BMI)，减轻肥胖症状。然而小檗碱抵抗肥胖的作用机制尚不清晰，加上其生物利用度较差的特征限制了其在治疗肥胖和相关代谢性疾病方面的应用。另外，小檗碱对棕色脂肪和米色脂肪形成尤其是分化过程的作用尚未可知。本论文的研究目标主要在于阐明小檗碱对棕色和米色脂肪分化过程的作用和其作用机制以及考察小檗碱对人体棕色或米色脂肪活性的影响。 利用高脂饮食诱导肥胖(DIO)小鼠发现BBR可以显著减少白色脂肪含量、降低体重并改善糖脂代谢;利用代谢笼实验发现BBR慢性给药提高氧气消耗和能量消耗;18F-FDG-PET/CT实验发现BBR慢性给药增强肩胛骨处棕色脂肪活性，对腹部沟皮下和附睾白色脂肪则无明显作用;BBR慢性给药上调棕色脂肪和肾周脂肪中棕脂特异性和分化相关基因和蛋白的表达水平，但对腹部沟皮下和附睾白色脂肪中棕色化基因无明显影响。以上结果说明了BBR能够促进棕色脂肪分化以及肾周白色脂肪棕色化，但对腹部沟皮下和附睾白色脂肪无促进棕色化作用。在正常饮食小鼠中亦验证了小檗碱对棕色脂肪分化和产热活性的促进作用。体外细胞实验发现BBR能够促进原代棕色脂肪前体细胞分化并且能诱导间充质干细胞C3H10-T1/2细胞向棕色脂肪方向分化，相应地对原代腹部沟皮下和附睾白色脂肪前体细胞则无促棕色化作用。 机制上，BBR在体内外均能激活AMPK信号通路。在体外细胞水平将AMPK敲低后发现，BBR对棕色脂肪分化的促进作用明显减弱，对PRDM16表达的上调作用被阻碍，提示BBR可能是通过AMPK通路来激活PRDM16的表达。利用脂肪特异性AMPKα1/2敲除小鼠模型验证了BBR促进棕色脂肪分化和产热的作用依赖于AMPK信号通路。对棕色脂肪细胞分化过程中检测发现BBR可显著提高三羧酸循环中间代谢产物α-酮戊二酸(α-KG)的含量，α-KG的水平可影响去DNA甲基化酶(TET)的活性;DNA甲基化免疫共沉淀实验(MeDIP)发现Prdm16启动子上DNA的5-甲基化胞嘧啶修饰水平明显降低，相应的5-羟甲基化胞嘧啶修饰水平显著升高，提示BBR可能通过降低Prdm16启动子甲基化水平从而促进其转录表达。体内外水平均发现BBR促进棕色脂肪分化关键调控因子PRDM16的表达，染色体免疫沉淀实验证明PRDM16在Ucp1增强子和启动子区域的富集增加。利用PRDM16敲低的稳转细胞发现，BBR促进棕色脂肪分化依赖于PRDM16因子;利用棕色脂肪特异性PRDM16敲低的动物模型发现，BBR对棕色脂肪产热活性的增强依赖于PRDM16因子。以上结果表明BBR通过AMPK-α-KG-PRDM16轴促进棕色脂肪分化和产热活性。此外，利用18F-FDG-PET/CT技术发现NAFLD患者口服BBR四周可以明显促进人体棕色脂肪的含量和活性，降低体重并改善胰岛素敏感性。在体外细胞水平也证明BBR能够促进人源棕色脂肪前体细胞分化过程。 综上所述，本论文开展全面评价了小檗碱对棕色和米色脂肪分化以及能量代谢的作用，在体内外水平阐明BBR促进棕色脂肪分化和产热的作用机制。这有助于进一步加深对小檗碱抵抗肥胖作用机理的认识与理解，为治疗肥胖及相关代谢性疾病提供潜在候选药物和新策略。
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