摘要
氧气在正常代谢时经不完全还原可生成活性氧物种(ROS，Reactive Oxygen Species)。活性氧和蛋白质、核酸、脂质体等多种生物分子发生相互作用引起氧化应激或信号转导过程，与许多生理功能(如细胞老化和凋亡等)和病理过程(如心脑血管疾病、癌症、阿尔兹海默症等)密切相关。蛋白质半胱氨酸残基是细胞内对活性氧最为敏感的巯基侧链，在活性氧的作用下，巯基侧链发生次磺酸化并引起蛋白质结构和功能变化，故蛋白质次磺酸化是活性氧信号转导的关键因素之一，影响如PI3K、MAPK、NF-κB等许多信号通路。如果胞内存在过量的活性氧，蛋白质次磺酸又会发生进一步氧化生成蛋白质亚磺酸。蛋白质亚磺酸化作为一种新的调控蛋白质结构和功能的翻译后修饰，在氧化还原过程中扮演了重要角色，具有非常重要的生理学功能和病理学意义。作为一种广泛存在的蛋白质氧化修饰的稳定产物，蛋白质亚磺酸是氧化应激的重要标记物之一。蛋白质亚磺酸化所引起的蛋白质结构和功能的变化也被发现与一系列的细胞活动、细胞进程乃至疾病的发生发展密切相关。此外，由于蛋白质亚磺酸还原酶的发现，使得蛋白质亚磺酸的可逆还原在调控细胞氧化还原状态和信号转导中扮演了重要角色。 本工作发展了一种与蛋白质亚磺酸选择性化学偶联的反应，在此基础上设计并合成了高效、高选择性的蛋白质亚磺酸标记试剂，将其应用到了细胞内，实现了蛋白质亚磺酸的原位检测。同时通过富集实验将胞内对ROS敏感的亚磺酸化蛋白质进行了蛋白组学分析，这对研究与蛋白质亚磺酸化相关的生理活动、病理过程以及信号转导作用具有非常重要的意义。 进行的主要创新性工作如下: 1.从磺酰胺和次磺酰胺的稳定性差异出发，设计并合成了一系列选择性与亚磺酸反应的化合物并对这些化合物的结构进行了优化，考察了最优模型化合物与亚磺酸反应的普适性以及不同缓冲溶液体系和不同pH值对模型化合物与苯亚磺酸钠反应的影响。 2.在最优模型化合物的基础上设计并合成了蛋白质亚磺酸标记试剂。 3.采用EASY-SprayTM蛋白质质谱法对模型化合物与β-乳球蛋白质亚磺酸的反应位点进行了表征，再次证明羟胺-O-磺酸类衍生物具有较好的选择性。 4.通过凝胶电泳实验，以β-乳球蛋白质为模型对荧光标记试剂和生物素标记试剂的标记能力进行了验证。 5.对胞内蛋白质亚磺酸进行了原位标记，说明蛋白质亚磺酸标记试剂也能用于复杂的生物体系;采用激光共聚焦显微镜成像技术和蛋白质免疫印迹实验探讨了活性氧和蛋白质亚磺酸还原酶对蛋白质亚磺酸化的影响，同时研究了蛋白质亚磺酸在胞内的分布情况，结果显示蛋白质亚磺酸主要分布在细胞质中。 6.对胞内亚磺酸化蛋白质进行了富集分析，研究了在ROS调控下胞内亚磺酸化蛋白质的变化情况，结果发现在H2O2作用下，易发生亚磺酸化的蛋白质有145个，这些蛋白质主要参与细胞的代谢和信号转导过程，与内分泌和代谢疾病、神经退行性疾病、癌症及传染病等有关。而虽对外加H2O2不敏感但亚磺酸化受氧化还原调控的蛋白质有197个，这些蛋白质则主要参与细胞的翻译、氧化还原、代谢和磷酸化过程，同样也与信号转导和许多疾病有关。
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