摘要
背景 食管癌是全球十大最常见的恶性肿瘤之一，且具有预后不良的特征，每年全球约有四十万人死于食管癌，其中我国的死亡病例占了全球总死亡病例的一半以上。食管癌从组织学上分为腺癌和鳞癌，西方国家以食管腺癌为主，而我国以食管鳞癌为主；食管鳞癌是具有中国特色的恶性肿瘤，占我国食管癌的绝大多数(90%以上)，具有高侵袭、高复发、高转移的特征，尽管随着医学水平不断提高、治疗方案不断改善，其5年生存率也仅为25%左右。食管鳞癌的临床治疗仍缺乏特异性的分子靶点和有效的靶向治疗药物。显然，迫切需要筛选和鉴定新的食管鳞癌关键分子并进一步阐明食管鳞癌的发病机制，将有助于开发更多创新及有效的治疗手段，以提升食管鳞癌患者的预后。 RacGTP酶激活蛋白1(RacGTPase-activating protein 1，RACGAP1)属于GTP酶激活蛋白家族的一员，其作用于细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，CDC42)以及RAC1(RacFamilySmallGTPase1，Rac相关的C3肉毒素底物1)等RhoGTP酶家族成员，促进它们将GTP水解为GDP从而促进细胞内信号通路的传导。多个研究表明RACGAP1在多种恶性肿瘤中高表达，且其高表达与癌症患者的预后不良及多项临床病理特征显著相关。然而RACGAP1在食管鳞癌中的表达情况及临床意义特别是对预后判断的价值几乎没有报道，另外在食管鳞癌中RACGAP1异常高表达的机制以及作为治疗靶点的潜力仍有待进一步阐明。 目的 本课题以食管鳞癌为研究的疾病模型，选择RACGAP1蛋白作为目标分子，明确食管鳞癌中RACGAP1的表达情况并分析其表达的临床意义，阐明它在食管鳞癌发展中的作用及预后判断价值，揭示其异常高表达的机制及探索作为治疗靶点的潜力。 方法 下载食管鳞癌公共数据基因芯片表达谱数据及TCGA(the cancer genome atlas)转录组测序数据，运用生物信息学分析RACGAP1在食管鳞癌和正常组织中的表达差异；应用免疫蛋白印迹(immunoblotting)技术以及实时荧光定量PCR(real time PCR)分析食管鳞癌组织和正常食管上皮组织中，RACGAP1在蛋白水平和mRNA水平是否存在表达差异；分析探讨RACGAP1在食管鳞癌中高表达对预后的影响；采用MTT(3-(45)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-35-di-phenytetrazoliumromide)法和平板克隆形成实验研究RACGAP1在食管鳞癌增殖中的作用。细胞周期及免疫荧光检测研究抑制RACGAP1的表达导致细胞有丝分裂灾难；过表达及siRNA干扰技术研究E2F3对RACGAP1的表达调控，荧光素酶报告基因研究E2F3对RACGAP1启动子的转录调控；最后，我们通过公开数据集挖掘，探讨RACGAP1在多种癌症中的表达状态、预后价值以及RACGAP1与E2F3表达的相关性。统计方法：Immunoblotting计量资料采用双尾t检验。数据统计分析采用SPSS19.0版(SPSS，Inc;Chicago，IL，USA)软件。采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验对RACGAP1表达与临床预后的相关性进行统计分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。 结果 通过对公共数据库4个食管鳞癌全基因表达谱数据分析，结果显示和正常食管鳞状上皮组织相比，RACGAP1基因的mRNA水平在食管鳞癌组织中显著高表达。利用前期收集的食管鳞癌标本进行验证，证实RACGAP1基因的mRNA水平在食管鳞癌组织中呈高表达。虽然临床病理特征和RACGAP1的mRNA相关性分析显示RACGAP1表达水平与T分期，N分期，M分期，临床分期以及病理分级没有显著相关，但和食管鳞癌复发成正相关，生存分析结果显示RACGAP1的mRNA水平越高预示食管鳞癌患者更短的总生存时间。另外，通过从蛋白水平的检测也明确RACGAP1在食管鳞癌中呈显著高表达。 细胞功能实验显示干扰RACGAP1的表达能显著抑制食管鳞癌细胞的体外生长及克隆形成能力，另一方面过表达RACGAP1能促进食管鳞癌细胞的体外生长及克隆形成能力。 细胞周期流式分析结果表明干扰RACGAP1的表达能显著抑制细胞周期的进程，同时导致大量细胞的死亡，表现为干扰RACGAP1的表达后sub-G1期的细胞比例以及多倍体细胞比例明显增加。免疫荧光结果显示干扰RACGAP1的表达后细胞发生严重的有丝分裂灾难，表现为多核细胞比例显著增多。 通过生物信息学分析及实验验证证实了RACGAP1作为一个新的细胞周期相关基因并受细胞周期关键癌转录因子E2F3的转录调控。相关性分析也显示E2F3的mRNA水平与RACGAP1的mRNA水平呈正相关。另外，存在E2F3拷贝数扩增的食管鳞癌组织中表达更高水平的RACGAP1。 最后，泛癌症分析发现RACGAP1在大多数常见恶性肿瘤中高表达，其高表达与患者更差的预后相关；E2F3与RACGAP1表达呈正相关，E2F3拷贝数增加的肿瘤表达更高水平的RACGAP1。 结论 食管鳞癌患者中RACGAP1的异常高表达与患者的预后密切相关；且通过siRNA下调RACGAP1的表达能诱导食管鳞癌细胞发生严重的有丝分裂灾难，进而诱导大量细胞死亡，从而抑制食管鳞癌细胞的生长，提示其在食管鳞癌的恶性进展过程中扮演重要角色；且RACGAP1是E2F3的真正转录调控靶点。因此，RACGAP1有可能成为预测食管鳞癌不良预后的分子标志物以及作为靶向治疗的分子靶标。
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