摘要
植物青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物土传病害，被称为植物癌症。青枯雷尔氏菌具有极强的侵染性和广泛的寄主范围，可以感染50多个科，几百种植物，包括烟草、花生、番茄、马铃薯、茄子等重要经济作物。青枯病在我国南方地区发病较为严重，是最具破坏性的植物病害之一。青枯雷尔氏菌适应性强，多样性高，现有的对青枯病病害的防治措施并不能很好的抑制青枯病的蔓延。为了寻找安全绿色的防治措施，噬菌体防治越来越受到人们的重视。 噬菌体是能够感染细菌的一类病毒，在自然界中普遍存在，有细菌的地方就有噬菌体的身影。丝状噬菌体是噬菌体根据形态学分类的一类，由于不能直接杀死细菌一直以来被人们忽视。丝状噬菌体能够持续感染细菌，再从受感染的细菌内源源不断的分泌出来，许多丝状噬菌体能够将遗传物质整合到宿主菌基因组中，形成溶源的原噬菌体。本文利用丝状噬菌体的这一特性，通过生物信息学预测，在青枯菌Bg07的基因组中发现一丝状噬菌体的完整原噬菌体序列，命名为RSBg。从Bg07的培养上清中分离得到该丝状噬菌体，噬菌体RSBg能显著延缓宿主菌GMI1000的生长，但不裂解被感染的青枯菌，且不影响宿主菌的最终生长量。通过透射电子显微镜观察发现，RSBg具有典型的丝状结构，长约4200nm，直径约为30nm。通过提取RSBg的基因组DNA，PCR扩增、测序获得了噬菌体RSBg基因组整合连接点的侧翼DNA序列，结合该部分DNA序列及RSBg原噬菌体序列，分析发现噬菌体RSBg基因组DNA全长7.5kb，共编码11个基因。 盆栽试验显示，直接施用噬菌体RSBg对番茄青枯病的生防效果较弱，所以本文对噬菌体RSBg进行了遗传改造。本文通过PCR分段扩增，体外重组克隆，成功将噬菌体RSBg全长序列克隆到pUC19上，获得了pUCRSBg。然后在pUCRSBg基础上，插入了“基因剪刀”cas9基因以及靶向青枯菌的致病基因关键调控因子hrpB基因的sgRNA序列，并成功获得该重组质粒pUCRSBgcas9hrpB。以期将该重组质粒转化青枯菌后，有望获得具有侵染性的人工重组噬菌体，该重组噬菌体将特异性靶向剪切青枯菌hrpB，从而发挥更好的生防作用。
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