摘要
目的：糖尿病肾病(DN)是糖尿病引起的一种微血管并发症，严重影响人们的健康。研究表明长期高血糖诱导的炎症状态参与DN发生发展过程。白细胞介素-6(IL-6)作为双重功能的细胞因子，在炎症反应中发挥重要的作用，涉及多种自身免疫性疾病；本文探讨抗IL-6R单域抗体融合蛋白对大鼠糖尿病肾损伤的改善作用的影响并探讨其相关机制，为改善DN的治疗提供新的治疗策略及重要的药物候选物。 方法：(1)抗IL-6R单域抗体融合蛋白(VHH1-1)的制备：IL-6R单域抗体融合蛋白重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中，基因测序得到序列正确的菌株，经IPTG诱导靶蛋白表达，然后超声破碎、尿素梯度洗涤得到粗蛋白，再通过磁珠纯化等步骤得到目的蛋白。(2)VHH1-1的活性分析：采用ELISA进行抗原抗体亲和力分析；MTT法观察RA-FLS细胞增殖能力的变化和划痕实验观察细胞迁移的影响；(3)VHH1-1的大鼠体内活性分析：1型糖尿病动物：9周龄清洁级级SD雄性大鼠随机分为两组，模型组腹腔注射90mg/kg的STZ，正常组注射等量的柠檬酸钠缓冲液。成模后，随机分为4组：Model，Benazepril，VHH1-10.1mg/kg和VHH1-10.5mg/kg组(n=6)；2型糖尿病动物：将成模的24周龄清洁级GK雄性大鼠随机分为4组：Model，Metformin500mg/kg，VHH1-10.1mg/kg和VHH1-10.5mg/kg组(n=6)。Wistar大鼠(n=6)作为年龄匹配的Control组；以上动物都每三天给药，定期检测体重和血糖水平；实验结束后，取肾组织进行染色(HE、PAS、Masson)观察病理变化；取血进行生化指标的检测；qRT-CR检测肾组织炎症因子和相关蛋白mRNA表达的变化；免疫组化观察STAT3和JNK1/2蛋白表达情况。(4)VHH1-1对HBZY-1细胞活性的影响：D-葡萄糖诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)构建体外高糖模型，通过MTT和流式分析实验观察细胞增殖活性，接着通过Westernblot测定HBZY-1细胞增殖相关信号通路蛋白表达。采用小干扰RNA敲低HBZY-1细胞IL-6的表达，qRT-PCR检测炎症因子(IL-6、TNF-α)和相关的蛋白mRNA的表达水平。 结果：(1)抗IL-6R单域抗体融合蛋白(VHH1-1)工程菌经过测序筛选后诱导表达、破碎、洗涤、纯化等步骤，得到纯度较高的目的蛋白。(2)ELISA分析表明VHH1-1与IL-6R具有特异亲和力，EC50为27.1nM；VHH1-1抗体能够抑制RA-FLS细胞的增殖和迁移，且VHH1-1抗体组(169、34、7pM)的迁移率分别降低22.78%、15.94%、7.82%；(3)与Control组相比，两种动物模型(GK大鼠、STZ诱导的SD大鼠)的Model组的血糖、Cr、BUN、AST、ALT生化指标显著升高，肾器官指数和肝器官指数均明显升高，体重降低明显(p<0.05)。且染色可见肾小球肥大、系膜增生、基底膜增厚、基质累积增加。肾组织中，炎症因子(IL-6、TNF-α)和相关蛋白的表达显著升高(p<0.05)。VHH1-1治疗能够缓解GKT2D大鼠和STZ诱导的T1D大鼠肾脏炎症、形态学损伤和肾功能不全。但VHH1-1治疗能显著降低T2D大鼠的血糖水平，而对T1D大鼠则影响较小。(4)成功构建HBZY-1细胞体外高糖模型，VHH1-1能显著抑制高糖诱导的HBZY-1细胞的增殖，其IC50为5.48pM，流式分析显示VHH1-1提高G0-G1期细胞数比例，抑制细胞周期的转换；Westernblot结果显示VHH1-1能够下调CyclinD1和CyclinE1的蛋白表达，qRT-PCR结果显示能够上调p21和p53的表达，进一步验证其对细胞周期的影响；Westernblot结果显示VHH1-1抑制JAK2/STAT3信号通路，抑制下游分子CyclinD1的活性，从而引起周期的阻滞；siRNA-IL-6干预，能够降低炎症因子(IL-6、TNF-α)和相关的蛋白mRNA的表达，对通路进行了验证。 结论：(1)抗IL-6R单域抗体融合蛋白(VHH1-1)具有很好的亲和力和特异性，能够抑制RA-FLS细胞迁移和增殖。(2)VHH1-1对T1D或T2D糖尿病引起的肾损伤均具有改善作用。(3)在高糖条件下，VHH1-1能够抑制HBZY-1细胞的增殖活性和减轻炎症反应。(4 )VHH1-1发挥肾保护机制可能与抗炎和抑制STAT3/JAK2通路有关。
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