摘要
石斑鱼是一种十分重要的海水养殖鱼类，近些年来随着石斑鱼养殖产业的不断扩大，水产环境逐渐恶化，各类水产疫病也频繁出现。其中，石斑鱼虹彩病毒(grouper iridovirus, SGIV)是对石斑鱼养殖业中危害最为严重的一种病毒性病原，该病原可在短时间导致石斑鱼大量死亡，一直以来都对我国石斑鱼养殖业的可持续发展构成了严重威胁，也是造成世界各地石斑鱼养殖业严重经济损失的重要病原之一。因此为了石斑鱼养殖业的可持续发展和扩大，研究开发可以防控石斑鱼感染SGIV的药物具有极其重要的意义。我国传统药用植物资源极为丰富，将药用植物及其提取物成分用于多种疾病的治疗更是有着悠久的历史且一直以来都药效显著。紫花地丁(Viola philippica)和金银花(Lonicera japonica Thunb.)是我国两种著名的药用植物，两者都有很好的清热解毒功效，金银花更是有“中药中的抗生素”的美称。此外有多项研究发现紫花地丁和金银花提取物对多种致病病毒均有较强的抑制能力，而且还具有增强免疫对动物机体产生保护作用等多种价值。基于药用植物紫花地丁和金银花均具有很好的抗病毒药理作用，本研究以紫花地丁和金银花为实验材料，首先研究了这两种药用植物对石斑鱼虹彩病毒的防治效果，然后又分别进一步对紫花地丁提取物抗石斑鱼虹彩病毒的作用机理以及金银花中发挥抗石斑鱼虹彩病毒作用的主要活性成分做了详细的探究。研究结果如下：(1)首先通过光学显微镜观察细胞形态变化以及CCK-8法检测细胞活力的方法确定了紫花地丁水提物的细胞安全、适宜工作浓度。研究确定了紫花地丁水提物在石斑鱼肝脾肾组织细胞系(GS细胞)中的安全工作浓度为≤10mg/mL。(2)确定了紫花地丁水提物对抗SGIV感染的效果。通过光学显微镜观察细胞形态变化、实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测以及荧光分子探针检测技术等方法充分证明了紫花地丁水提物对石斑鱼虹彩病毒感染在体外具有良好的抑制作用。(3)紫花地丁抗石斑鱼虹彩病毒机制研究。通过分析紫花地丁水提物对石斑鱼虹彩病毒粒子结构以及对病毒感染宿主细胞过程的影响，发现紫花地丁水提物对石斑鱼虹彩病毒粒子的结构没有影响，但会干扰石斑鱼虹彩病毒感染宿主细胞过程中的吸附、侵入和复制三个阶段，从而抑制石斑鱼虹彩病毒的感染。并且在石斑鱼虹彩病毒感染宿主细胞的吸附和复制阶段，紫花地丁对石斑鱼虹彩病毒的抑制效果最好。(4)确定了金银花提取物及其主要含有的各化合物成分在GS细胞中的安全、适宜工作浓度。其中，金银花水提物(L. japonica aqueous extracts, LAE)≤10mg/mL；绿原酸(chlorogenic acid, CGA)≤250μg/mL；隐绿原酸(crypthochlorogenic acid, CCGA)≤500μg/mL；异绿原酸A(isochlorogenic acid A, IAA)≤250μg/mL；异绿原酸B(isochlorogenic acid B, IAB)≤250μg/mL；异绿原酸C(isochlorogenic acid C, IAC)≤500μg/mL；咖啡酸(caffeic acid, CA)≤125μg/mL；木犀草素(luteolin, LT)和肌醇(inositol, IS)在浓度2000μg/mL时对GS细胞仍然没有明显的毒性作用。(5)确定了金银花提取物各化合物成分在体外抗石斑鱼虹彩病毒的效果。通过光学显微镜观察、实时荧光定量PCR技术检测和荧光分子探针检测技术等方法充分证明了LAE、IAA、IAB、IAC、CA、LT、IS在体外对石斑鱼虹彩病毒感染均具有良好的抑制作用，而CGA和CCGA则对石斑鱼虹彩病毒的感染没有显著的抑制效果。总的研究结果表明，中草药紫花地丁和金银花提取物均具有很好的抗石斑鱼虹彩病毒的作用，这对开发防治养殖石斑鱼虹彩病毒感染的药物具有重大前景意义。
NETL