摘要
随着人类对生态环境保护意识的不断提高，石油烃污染环境治理已成为焦点问题。目前，生物修复技术在石油烃污染场地修复方面展现出巨大的应用潜力，但石油烃具有毒性和疏水性，导致生物修复技术表现出降解周期长、效率低等不足。因此，探索和建立一种高效、环保、低耗的生物修复策略，对于污染场地修复具有重要意义。本文针对拟修复土壤中石油烃污染物-链烷烃(C13-C21)和多环芳烃(萘和菲)进行微生物修复策略构建及优化，并将所建立的最优降解策略应用于石油烃污染土壤治理中以评估修复特性，实现土壤石油烃污染治理达到土壤环境质量-建设用地土壤污染风险管控标准(试行)(GB 36600-2018)。具体研究结果将从以下三个方面展示: 第一方面：石油烃降解菌群富集及其对高浓度石油烃胁迫的响应 (1)利用不同浓度石油烃(1000-20000 mg/L)对活性污泥进行逐级梯度驯化，驯化结果表明：在气升式反应器(反应液体积1L、温度30℃、通气量2.0L/L?h、活性污泥接种量10mL)中，微生物菌群对高浓度石油烃(＞10000mg/L)降解效率显著低于低浓度石油烃(＜7000mg/L)，并且菌体优先降解短链烷烃(C13-C16)。同时，随着石油烃浓度的不断提高，细菌菌群多样性逐渐降低，优势菌群构成趋于稳定。 通过比较宏基因组学分析不同浓度石油烃(10000mg/L和20000mg/L)条件下微生物菌群功能可知，菌体通过提高环境适应、膜转运以及氨基酸代谢等功能丰度以抵御石油烃胁迫。然而，高浓度石油烃(20000 mg/L)可对微生物菌群消化系统、循环系统以及信号传导等功能模块产生抑制作用，造成微生物菌群代谢碳氢化合物效率下降。由于活性污泥存在微生物菌群冗余、相互作用复杂以及内含物成分不确定等因素而限制其应用，后续将从驯化后活性污泥中分离和构建混合菌群，进一步提高微生物降解高浓度石油烃效率。 第二方面：石油烃降解策略优化及其菌群代谢碳氢化合物功能特性分析 (2)针对拟降解石油烃污染物-链烷烃(C13-C21)和多环芳烃(萘和菲)，从驯化后活性污泥中，共分离、鉴定出6株石油烃降解菌，分别为D-1(Microbacterium)、D-2(Kocuria marina)、D-4(Kocuria rosea)、D-5(Microbacterium)、D-6(Staphylococcus capitis)以及D-7(Bacillus odysseyi)。 分别利用6株单菌进行5000mg/L、10000mg/L、15000mg/L石油烃(链烷烃和多环芳烃)降解试验，结果表明：经过14d降解试验，所有单菌降解5000mg/L石油烃效率均＞50%，但随着石油烃浓度的增加(浓度＞10000mg/L)，单菌降解总石油烃降解效率显著降低，且菌体生物量也随之下降。 为提高微生物降解高浓度石油烃效率，通过构建混合菌群(两株菌)以促进微生物代谢碳氢化合物。由混合菌群(两株菌)降解效率可知，D-4+D-6组合经降解条件优化(反应液体积80mL、温度30℃、转速200r/min、初始pH=7.0、菌体接种比例1∶1)后，上述组合经过14d降解试验对10000mg/L石油烃降解率可达到72.09±7.14%，其中链烷烃(C13-C21)和多环芳烃(萘和菲)剩余量分别为1618.31±116.85mg/L和1172.69±95.81mg/L。 (3)为进一步提高混合菌群(两株菌)降解石油烃效率，采用外源添加表面活性剂策略开展试验。在添加Tween80体系下，D-4+D-7组合(降解周期14d)降解10000mg/L石油烃效率可达到81.58±6.29%。由比较宏基因组学分析发现，添加Tween80的D-4+D-7组合中全局网路、氨基酸代谢、碳水化合物代谢功能模块的相对丰度增加。在添加鼠李糖脂的D-5+D-7组合中，膜转运、信号传导以及细胞运动功能模块的相对丰度明显增加，以促进石油烃的转运、吸收以及降解，并且上述组合石油烃降解基因-alkB和nah丰度也显著提高。最终，在添加鼠李糖脂体系(D-5+D-7组合)下，微生物总石油烃降解率可达到88.35±7.58%(14d降解周期)，其中链烷烃(C13-C21)和多环芳烃(萘和菲)剩余量分别为745.23±66.05mg/L和419.77±36.49mg/L。经过比较发现：本试验所构建的石油烃降解策略(鼠李糖脂结合D-5+D-7组合)效率最大，可完全用于理性指导下石油烃污染土壤修复技术中。 第三方面：理性指导下石油烃污染土壤生物修复特性 (4)在石油烃污染土壤修复(反应器体积60.0L、总石油烃含量9316.41±625.87mg/kg、温度20-25℃、含水量25%-30%)条件下，采用生物刺激(添加氮源、磷源)、生物强化(添加D-5和D-7)以及表面活性剂增溶技术(添加鼠李糖脂)相结合的综合方法，可显著提高石油烃污染土壤中细菌菌群多样性、石油烃降解菌(总石油烃、链烷烃、多环芳烃)数量以及各种酶(过氧化氢酶、脂肪酶、脱氢酶、磷酸酶、荧光素二乙酸酯水解酶)活性。在本部分修复策略应用修复126d后，石油烃污染土壤总石油烃含量已降至2558.29±138.59mg/kg，主要指标低于土壤环境质量-建设用地土壤污染风险管控标准(试行)(GB 36600-2018)，即总石油烃含量低于第二类用地筛选值4500mg/kg(对人体健康风险可以忽略)，已达到预期的生物修复石油烃污染土壤的目标。
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