摘要
研究目的： 遗传和表型变异不仅存在于不同患者的肿瘤之间（肿瘤间异质性，Intertumoral Heterogeneity），而且还存在于单个肿瘤内部（肿瘤内异质性，Intratumoral Heterogeneity）。肿瘤异质性造成了肿瘤细胞内信号通路调控的多样性，并促使表型变异的产生，这成为实现癌症个性化精准治疗的重大挑战。转录组表达模式的多样性和癌症干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）可塑性是肿瘤异质性的重要原因，同时肿瘤微环境的选择效应也可选择性地诱导产生多种细胞亚群。由于现有大多数研究都主要依赖于传统的转录组分析技术，因此无法全面解析肿瘤异质性产生和肿瘤内部演化规律及其调控机制。单细胞水平高通量测序技术的发展加速了对肿瘤驱动基因突变、异常信号调节通路和分子亚型的理解，为探索单细胞水平基因组学、转录组学和表观遗传学的特性提供了新方法新策略。近年来，单细胞转录组测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）已用于构建多种类型实质细胞和非实质细胞异质性图谱，以重新定义细胞组成类型，并发现生理和病理条件下的新细胞亚群。另外一些研究通过单细胞技术对颅内肿瘤、头颈癌、乳腺癌和肺癌等在内的多种实体瘤的进化和多样性提出了新的见解。 新兴的类器官（Organoid）技术允许在体外长期培养临床患者来源的肿瘤细胞，并且能够较好的维持细胞在体内的表型。最近类器官技术已被广泛应用于在体外研究各种类型肿瘤，包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌和胃肠道癌症等。类器官技术可以保留原始肿瘤的遗传变异和基因表达模式，并且保留在体内的转移潜能，因此可以更好的反映原代肿瘤细胞基本特征。源自肿瘤的类器官已成为肿瘤生物学，干细胞生物学和药物研究的强大工具。 目前有关肝胆系统类器官的研究已有少量报道，但肝胆肿瘤异质性与药物反应之间的内在联系尚不清楚。本课题使用单细胞转录组测序技术重点分析了科室前期已建立的7例患者源性肝胆系统肿瘤类器官（Hepatobiliary Tumor Organoid）肿瘤间和肿瘤内异质性，从单细胞水平延伸了对肝胆系统肿瘤耐药分子机理的认识，也为肝胆肿瘤治疗提供潜在的靶点。 研究方法： 1.应用单细胞转录组测序（Single-cell RNASequencing，scRNA-seq）在单细胞层面探索7例肿瘤类器官中整体基因表达水平差异； 2.应用Seurat算法对肿瘤类器官细胞进行分类、表达谱绘制，探索肿瘤内亚群的差异基因及其相关信号通路； 3.应用Monocle算法对不同肿瘤类器官细胞进行发展轨迹衍化分析，对肿瘤类器官进行包括细胞增殖、缺氧、EMT等生物行为的分析； 4.应用CellphoneDB算法对肿瘤细胞亚群中的共生系统相互作用进行分析，探究耐药机制产生的细胞间通讯模式； 5.结合TCGA数据库（TCGA database）评估耐药亚群中高表达基因GAPDH和NDRG1的预后风险。 研究结果： 1.收集科室前期构建的7例肿瘤类器官，包括4例肝细胞癌（HCC10、HCC272、HCC277和HCC285）、2例胆管细胞癌（ICC161和ICC284）、1例胆囊癌（GBC270）。利用10X Genomics测序技术，构建7例肿瘤类器官对应的scRNA-seq图谱，对各个细胞系的细胞周期和上皮分化状态进行评估,HCC277具有最强的增殖能力，HCC272间质转化水平最高； 2.HCC272高表达MET、PIK3R1、PRKCA、SHC1和STAT3，组成性激活PI3K-Akt和MAPK等下游途径，部分介导其耐药性的产生； 3.全面观察了之前报道的癌症干细胞样（CSC-like）标志物（PROM1、CD44、EPCAM、ANPEP、SOX9和OCT4）在肿瘤类器官中的表达情况，CD44+细胞的异常富集通过依赖Jak-STAT信号通路介导了HCC272细胞系耐药； 4.绘制肿瘤内异质性表达谱和衍化发育轨迹，筛选出共表达基因CTNNB1、HNRNPH1、ATP1B1、PPP1CB、NEAT1、MALAT1、SAT1、GAPDH、ANXA2和BRI3。不同亚群基因的差异性表达表明，在维持肿瘤类器官的发育中异质性细胞亚群起到了不同的关键作用； 5.高代谢状态高表达GAPDH的亚群塑造了肿瘤内的缺氧环境，介导CD44+细胞上调NEAT1，并激活Jak-STAT信号通路来促进耐药性的产生； 6.高代谢状态亚群共享基因包括：GAPDH、NDRG1、ALDOA和CA9，利用TCGA数据进行生存分析和独立风险因素评估发现，GAPDH和NDRG1可作为评估肿瘤预后的关键分子。 研究结论： 本课题使用单细胞转录组测序技术重点分析了科室前期已建立的7例患者源性肝胆系统肿瘤类器官（Hepatobiliary Tumor Organoid）肿瘤间和肿瘤内异质性，发现并评估了与细胞周期、缺氧和上皮分化状态有关的特征基因，初步确定了与肝癌耐药相关的细胞亚群特征及可能的信号通路。发现具有上皮-间质转化状态的HCC272具有广谱耐药性，同时存在PI3K-Akt和MAPK信号通路组成性激活，CD44阳性亚群介导了HCC272中耐药性的产生。低氧信号富集的代谢优势肿瘤类器官亚群可以上调CD44亚组中NEAT1的表达，并通过配体-受体相互作用介导依赖Jak-STAT通路的耐药性。此外，还发现在多个类器官中共有的代谢优势簇具有相似的特征基因（GAPDH、NDRG1、ALDOA和CA9）。多因素分析发现GAPDH和NDRG1的组合是一个独立的危险因素，可作为患者生存的预测指标。该研究丰富了我们对肝癌细胞异质性介导耐药分子机理的认识，也为肝胆肿瘤治疗提供潜在靶点。
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