摘要
研究背景： 赛多孢霉菌（Scedosporium）是一类广泛分布于自然界的机会性致病真菌，其在分类学上属于真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、小囊菌目（Microascales）、小囊菌科（Microascaceae）、赛多孢霉（Scedosporium）属，主要分布于潮湿的土壤、生活污水及易被石油等芳香烃类物质污染的加油站、炼油厂等附近的环境中。根据最新的分类学研究结果，既往人们所说的假阿什利霉（Pseudallescheria）和赛多孢霉菌（Scedosporium）现在均被划归为“赛多孢霉”，既往人们所说的“多育赛多孢霉”（Scedosporium prolificans）现被划出赛多孢霉属而归入Lomentospora属，命名为Lomentospora prolificans。目前，赛多孢霉属中能引起人类致病的主要包括7个种，其中最常引起人类感染的为尖端赛多孢（ S. apiospermum）、波氏赛多孢(S. boydii)和橙黄色赛多孢（S. aurantiacum）。近年来，赛多孢霉感染发生率不断上升，已成为继烟曲霉感染之后第二位的机会性感染丝状真菌，其感染呈世界性分布，但其流行病学特征有明显地区差异。例如，我国赛多孢霉临床分离菌株以尖端赛多孢霉和波氏赛多孢霉为主，而橙黄色赛多孢霉在澳大利亚等气候干燥炎热的国家较为多见。赛多孢霉引起人类感染的表现多样，既可在腔道中定植，也可导致局限性及播散性感染，同时还可在溺水和雪崩受害者中引起致命性中枢神经系统感染。 尖端赛多孢霉和波氏赛多孢霉是临床上最常见的赛多孢霉致病菌种，近年来其引起的侵袭性感染病例不断增加，治疗也较为困难。不同菌种的赛多孢霉以及分离自不同地域或来源不同的赛多孢霉对临床常用抗真菌药的敏感性常存在差异。然而，目前临床微生物实验室对赛多孢霉的鉴定方法较为局限，不能将赛多孢霉快速准确的鉴定至菌种水平，临床医师因此常被迫进行经验性抗真菌治疗。两性霉素 B作为一种广谱抗真菌药，常被用于经验性抗真菌治疗，而大多数赛多孢霉菌株对两性霉素 B天然耐药，常导致患者病情延误，预后较差。 目前，关于分离自我国的赛多孢霉菌株的遗传多样性及体外药敏监测等工作还很不足，尚未确定其对常见抗真菌药物敏感性的临床折点和流行病学折点，基因型分布特征及地理分布的差异也尚未明确。因此，本研究拟对近20年来收集自福建、山东、北京、湖南等多个省份的赛多孢霉临床株采用多位点序列分型及全基因组测序分析等新型的分子标记技术进行研究，分析相关菌株的起源、基因型分布等遗传多样性特征和体外抗真菌药物敏感性特征，为我国赛多孢霉感染的精准抗真菌治疗提供科学依据和研究基础。 研究目的： 第一，使用多基因序列分型对收集到的赛多孢霉菌株进行基因型水平的鉴定及系统发育分析，明确其种内基因型分布及相关基因型之间的进化关系等遗传多样性特征；第二，对赛多孢霉进行体外药敏试验，揭示不同抗真菌药物对我国赛多孢霉的敏感性，为临床精准抗真菌治疗方案的制定提供参考依据；第三，采用新一代基因组测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术对筛选出的独特基因型或表型的赛多孢霉菌株进行全基因组水平的研究，分析其中优势基因型菌株及独特表型菌株的遗传起源及耐药进化的分子机制，为我国赛多孢霉感染诊治水平的提高提供科学基础。 研究方法： 第一部分：对收集自福建、山东、北京、湖南、安徽、广西等不同省份三级甲等医院的赛多孢霉临床分离株的临床及流行病学信息进行汇总整理，并采用 ITS（internal transcribed spacer region）和BT2（β-tubulin）两个基因片段测序，将所得序列拼接后在 NCBI数据库 BLAST鉴定至种水平；采用国际人和动物真菌病学会(International Society for Human and Animal Mycology, ISHAM)推荐的多位点序列分型(Multi LocusSequence Typing, MLST)对其进行Sequence type(ST)水平的基因型分型；使用MEGA7.0软件用最大似然法（ML）构建系统发育树，研究不同基因型菌株之间的进化关系。 第二部分：采用美国临床实验室标准化委员会推荐的丝状菌标准的肉汤微量稀释法（CLSI M38-A2法）对赛多孢霉进行8种一线抗真菌药的体外药敏试验，研究相关菌株的体外药敏特性。 第三部分：使用PacBio平台，对赛多孢霉参考菌株进行全基因组三代测序，组装高质量参考基因组。结合转录组测序与生物信息学分析方法，全面注释赛多孢霉参考基因组。对收集到的分离自我国的赛多孢霉临床分离株进行全基因组二代测序，通过对Cyp51基因进行系统发育分析，采用全基因组SNP及主成分分析等生物信息学方法分析相关赛多孢霉的遗传起源及耐药进化的分子机制。 结果： 第一部分：本研究中所收集到的赛多孢菌种包括尖端赛多孢霉（S. apiospermum）、波氏赛多孢霉（S. boydii）、橙黄色赛多孢霉（S. aurantiacum）、S. dehoogii、S. ellipsoidea、S. angusta共6种赛多孢霉，其中以尖端赛多孢霉（37.0%，10/27）和波氏赛多孢霉最为多见（37.0%，10/27）。菌株主要分离自肺部相关组织标本（37.0%，10/27），且尖端赛多孢霉（40.0%，4/10）为肺部感染的优势致病菌种；在其他类型标本的赛多孢霉菌株中，波氏赛多孢霉（47.1%，8/17）则多于其他菌种。本次共收集到4株（14.8%,4/27）橙黄色赛多孢霉，其中3株（75.0%，3/4）为肺部感染，1株（25.0%，1/4）为中枢神经系统感染，该菌种既往在我国大陆地区未见报道。我国尖端赛多孢霉、波氏赛多孢霉和橙黄色赛多孢霉的优势ST型分别为ST17、ST3和ST92，且在尖端赛多孢霉中首次发现了3个新的ST型（ST40、ST41、ST42）。 第二部分：在本研究所应用的8种抗真菌药物中，伏立康唑(Voriconzole, VOR)(MIC50=0.25ug/ml; MIC90=0.5ug/ml)和米卡芬净(Micafungin, MCF)(MIC50=0.25ug/ml; MIC90=0.5ug/ml)抗菌活性最高；两性霉素B(Amphotericin B, AMB)的抗菌活性最低(MIC50=8ug/ml; MIC90>16ug/ml)，值得进一步研究及后续警惕监测。 第三部分：本研究获得了与目前公共数据库中赛多孢霉基因组相比质量更好的参考基因组，利用结合生物信息学和转录组测序注释出了10423条非冗余蛋白质编码基因组，并进行了COG、KOG、KEGG和GO注释，从基因组学层面对赛多孢霉进行了详细的分析。其次，对分离到的临床样本的Cyp51基因构建系统发育树，发现赛多孢霉的耐药性与Cyp51基因的进化有一定的相关性。本研究发现，基于全基因组SNP的分型与基于多个管家基因位点的MLST分型有明显差异；同时，通过与欧洲赛多孢霉菌株的群体进行对比，我们还发现，分离自我国的赛多孢霉临床分离株的遗传多样性较低，与来自欧洲的赛多孢霉菌株群体多样性特征有明显差异。同时，分离自我国的尖端赛多孢霉比波氏赛多孢霉遗传多样性丰富。 研究结论： 本研究中收集自全国多个省份的赛多孢霉临床分离株菌种主要包括尖端赛多孢霉、波氏赛多孢霉、橙黄色赛多孢霉、S. dehoogii、S. ellipsoidea、S. angusta共6种。其中，尖端赛多孢霉和波氏赛多孢霉为我国赛多孢霉感染的优势致病菌种，同时在尖端赛多孢霉中首次发现了3种新的ST型。赛多孢霉体外药敏试验结果显示，伏立康唑和米卡芬净对本次研究收集的赛多孢霉菌株抗真菌活性最高，两性霉素 B抗真菌活性最低。为提高对赛多孢霉感染临床诊治水平，未来应加强对我国赛多孢霉临床与环境分离株耐药趋势及遗传多样性的系统研究及监测。
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