摘要
莲子心是莲（Nelumbo nucifera）的成熟种子中干燥的幼叶和胚根，为传统中药材，具有清心安神、降血脂、降血压等作用。莲子心重要的活性成分为异喹啉和阿朴菲类生物碱，药理学研究表明该类生物碱具有降血压、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等活性，特别是其在调节脂肪代谢方面的作用引起广泛关注，但因莲子心生物碱制备困难，口服生物利用度低，作用机制不明确，严重限制其应用。本研究旨在建立一种莲子心生物碱提取、分离和纯化工艺，在此基础上，构建莲子心生物碱纳米自微乳载药体系，提高其口服生物利用度，延长其作用时间，并通过细胞及动物体内实验探究其降血脂活性和作用机理，为其临床应用提供有效保证。主要研究内容和结果如下： （1）莲子心生物碱的提取工艺研究：研究建立莲子心生物碱硅胶薄层色谱鉴别法、高效液相色谱和紫外分光光度分析方法，并对方法学进行系统考察。采用酸水提取莲子心中的生物碱，首先考察不同的pH、不同的料液比、提取时间、提取次数对莲子心生物碱的提取效率，在单因素实验的基础上，通过正交实验优化莲子心生物碱提取工艺。实验结果表明：使用盐酸水溶液可以更充分的提取莲子心中生物碱类化合物，最佳提取工艺为提取溶液pH值为2.0、料液比1：30、提取时间12h、提取次数3次，其中莲子心总生物碱的得率为9.88%，甲基莲心碱的得率为1.11%。方法学实验结果表明：所测结果精密度、重复性、稳定性较好，加样回收率高，方法可行。 （2）莲子心生物碱的分离、纯化工艺研究：采用有机溶剂萃取法获得莲子心总生物碱、大孔吸附树脂结合制备型液相色谱对莲子心生物碱进行分离纯化。比较二氯甲烷和乙酸乙酯对莲子心生物碱的提取效率；研究AB-8、DM-130、LX-60和聚酰胺4种不同极性的树脂对莲子心生物碱的吸附和解吸附特性，优选最佳树脂种类；分别考察不同浓度的甲醇溶液作为洗脱剂、不同的上样量、不同的流速，比较研究制备型液相色谱分离莲子心生物碱单体化合物，优选出最佳的色谱方法。实验结果表明：使用二氯甲烷萃取得率优于使用乙酸乙酯，其得率为7.58%；LX-60大孔吸附树脂富集莲子心生物碱效果较好，其吸附率为84.61%，解吸附率为70.11%；使用制备型液相色谱条件流动相为甲醇-水（80-20），柱温室温，流速6.0mL/min，色谱柱上样量100.0mg，收集时间180min，可以快速高效的获得4种单一的莲子心生物碱化合物，使用HPLC检测峰面积占比大于98%。 （3）研究建立莲子心总生物碱纳米自微乳构建方法：首先测定莲子心生物碱在不同的油相、不同的乳化剂和助乳化剂中的溶解度，采用绘制伪三元相图方法，优选出最佳的油相、乳化剂和助乳化剂；在伪三元相图的基础上进一步处方优化，以油相的质量（X1）、乳化剂和助乳化剂质量比Km（X2）为自变量因素，以纳米乳的粒径（Y1）、Zeta电位（Y2）、载药量（Y3）为考察指标，以总评OD值为效应变量，利用Design-Expert8统计软件进行两因素、五水平的星点设计，优选出最佳的辅料成分和配比。实验结果表明：莲子心总生物碱自微乳最优处方为油酸乙酯（15%）、RH40-PEG400（2：1，85%），该处方最大载药量约8%，其所成乳剂粒径约为20nm，Zeta电位11mV，为一稳定的纳米自微乳载药体系。 （4）莲子心生物碱对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响：首先采用MTT法测定莲子心总生物碱及各单体化合物对3T3-L1前脂肪细胞毒性，以确定给药浓度；采用油红O染色检测3T3-L1细胞分化，TG试剂盒检测3T3-L1细胞内脂质含量，Western blot法检测蛋白表达，研究莲子心生物碱对3T3-L1前脂肪细胞脂肪代谢的影响。实验结果表明：与模型组相比，莲子心生物碱成分可以有效的降低3T3-L1细胞内甘油三酯的含量，其中莲子心总生物碱为42.3%、莲心碱为14.5%、异莲心碱为14.3%、甲基莲心碱为14.9%，同时莲子心生物碱可以不同程度的降低PPARγ和C/EBPβ蛋白的表达，抑制脂肪的形成。 （5）甲基莲心碱和甲基莲心碱纳米自微乳在大鼠体内药代动力学初步实验：选用两组SD大鼠，分别口服给药甲基莲心碱纳米自微乳和甲基莲心碱羧甲基纤维素钠混悬液，给药剂量200mg/kg，分别在给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、10h从大鼠眼眶取血0.5mL，高效液相分析不同时间甲基莲心碱血药浓度，比较两者的最大血药浓度和达峰时间，确定纳米自微乳和非纳米自微乳甲基莲心碱的吸收消除情况。实验结果表明：Nef在大鼠血液中有吸收，经过纳米自微乳处理后的Nef比使用非纳米化的Nef在最大血药浓度和达峰时间都有所提高，其最大血药浓度提高了27.32%，达峰时间快0.25h，经纳米化处理的Nef有效的提高了其生物利用度。 本研究建立了莲子心中生物碱成分的提取、分离纯化工艺，并成功构建纳米自微乳载药系统；通过体外3T3-L1细胞实验，初步显示莲子心生物碱成分可以有效的降低细胞内脂肪积累，降低甘油三酯水平，降低PPARγ和C/EBPβ蛋白的表达；药代动力学研究显示，纳米自微乳载药体系，可以显著提高莲子心生物碱的最大血药浓度和达峰时间，提高其生物利用度。本研究结果为莲子心及其生物碱的临床应用提供了理论基础和技术保证。
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