摘要
指状青霉(Penicillium digitatum)侵染造成的绿霉病(Green Mold)是造成柑橘采后损失的主要病害。作为一种绿色杀菌剂，二氧化氯(ClO2)已被广泛应用于果蔬的保鲜中。目前，关于ClO2在果蔬采后的应用主要集中在对果蔬的保鲜和抗病性上，有关ClO2对采后真菌抑菌机制及致病力影响的系统研究很少。本文选取了金桔、蜜柑、秘鲁橘子和葡萄柚四个不同品种的柑橘果实，并以指状青霉为目标菌株。首先明确了二氧化氯对指状青霉在柑橘果实上及在体外的抑菌效果，其次通过膜靶向和有机酸代谢分析，从生理生化层面阐释了ClO2对指状青霉的抑菌机制，最后从转录水平分析了ClO2对指状青霉的抑菌机制。主要结果如下： 1.ClO2熏蒸处理对指状青霉具有良好的抑菌效果。0~250mg/L ClO2可以显著降低指状青霉的菌落生长（P＜0.05），0~50mg/L ClO2可以显著抑制指状青霉孢子萌发和芽管生长（P＜0.05）。50mg/L的ClO2处理，在整个观察期未见指状青霉萌发。损伤接种法发现200~1800mg/L ClO2熏蒸可以有效控制金桔、蜜柑、秘鲁橘子和葡萄柚四个品种柑橘果实的绿霉病发生。同时发现，ClO2可有效维持柑橘果实在贮藏期间的理化指标，如硬度、质量损失率、可滴定酸、可溶性固形物、VC等，这为ClO2应用到柑橘采后贮藏提供了依据。 2.ClO2可以通过破坏指状青霉细胞质膜完整性发挥膜靶向抑菌作用。结果显示100和200mg/L ClO2诱导细胞发生早期凋亡和晚期凋亡，200mg/L ClO2通过增加荧光强度（平均值118到1225）使线粒体膜电位降低，活细胞率从96.8%降低到6.1%，细胞质膜完整性被破坏；丙二醛（MDA）、核苷酸泄漏量（OD260）升高，细胞膜出现质膜过氧化、渗透性增加；菌丝体、线粒体形态改变，出现褶皱、黏连、断裂、塌陷等现象，质膜形态被破坏。 3.ClO2可以通过抑制柠檬酸的合成及分泌降低了指状青霉的致病力。ClO2处理后，指状青霉胞内柠檬酸含量降低，三羧酸循环过程中的一些酶如琥珀酸脱氢酶（SDH）、胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）、苹果酸脱氢酶（MDH）等活性降低。胞内ATP含量下降，胞外ATP含量上升，柠檬酸合成及正常的能量代谢被破坏。同时，损伤接种指状青霉后的柑橘果实发病部位pH较健康果实下降0.5~1个单位，果实内柠檬酸含量升高，乌头酸酶活性升高，柠檬酸合酶降低。而ClO2熏蒸处理后，果实柠檬酸含量减少，苹果酸、富马酸、抗坏血酸等有机酸的含量在贮藏期下降，且乌头酸酶、柠檬酸合酶、苹果酸脱氢酶与健康果实相差不大。这表明二氧化氯导致指状青霉分泌有机酸受阻，对果实自身有机酸代谢的影响也减弱，进而降低了其致病力。 4.转录组学分析揭示了ClO2抑制指状青霉的基因差异显著。ClO2对与指状青霉细胞膜代谢和能量代谢的相关基因影响显著，膜铁渗透酶、外聚半乳糖醛酸酶、醛脱氢酶、甲壳素合成酶基因上调，醛脱氢酶、NADH-细胞色素b5还原酶、磷脂酶C PLC-C基因下调。差异基因涉及代谢途径、氰氨基酸代谢、抗生素的生物合成、氯烷和氯烯的降解、酪氨酸代谢等20条主要通路。实时荧光定量PCR分析验证差异基因的表达。转录组学数据与前期结果相吻合，表明二氧化氯能够通过上调或下调相关基因的表达，破坏蛋白质合成及酶活发挥，导致指状青霉代谢途径受阻，进而影响或抑制生长。
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