摘要
目的： 1.本研究旨在通过网络药理学方法探究滋肾育胎丸治疗先兆流产的作用机制，并利用大鼠先兆流产模型验证滋肾育胎丸治疗先兆流产的网络药理学预测结果。 2.通过热水回流提取技术获得滋肾育胎丸粗多糖（ZYPPs），评价滋肾育胎丸的多糖生物学活性。 3.以斑马鱼为模型研究滋肾育胎丸对胚胎早期发育的影响，评估其安全性。 方法： 1.采用网络药理学方法对滋肾育胎丸治疗先兆流产的潜在作用机制进行分析。通过检索中药系统药理数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database,TCMSP）、中科院化学专业数据库，获取滋肾育胎丸有效成分及其作用靶点。通过检索GeneCards数据库获取先兆流产相关的靶点，取交集得到滋肾育胎丸作用于先兆流产疾病的靶点，然后构建交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络。利用DVIVD数据库以及Omicshare软件对关键靶点进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,KEGG）进行富集分析和可视化分析，得到参与滋肾育胎丸治疗先兆流产的信号通路。通过Cytoscape软件构建化合物-靶点-通路网络，通过Autodock vina软件将23个关键靶点中与滋肾育胎丸的32个主要活性成分分别进行分子对接。预测滋肾育胎丸的活性成分通过作用于富集的信号通路从而达到治疗先兆流产的效果。 2.基于网络药理学分析结果，设计动物实验验证滋肾育胎丸治疗先兆流产的作用机制。将妊娠第一天的孕鼠随机分组，分为阴性对照组、模型组（米非司酮组）、阳性组（地屈孕酮组）、滋肾育胎丸治疗组。阴性对照组与模型组连续灌胃生理盐水，阳性对照组连续灌胃地屈孕酮，滋肾育胎丸治疗组连续灌胃滋肾育胎丸，所有组灌胃10天。除阴性对照组外，其余组在第10天下午给予米非司酮处理。观察指标：（1）各组孕鼠体重变化，子宫整体形态变化；（2）苏木精-伊红染色观察各组孕鼠子宫组织病理变化；（3）酶联法检测孕鼠血清中雌二醇（Estradiol,E2）和孕酮（Progesterone，P）含量；（3）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测孕鼠子宫组织中PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、炎症以及细胞凋亡相关基因的表达水平。 3.基于斑马鱼模型研究滋肾育胎丸粗多糖的药理活性。采用热水回流技术提取滋肾育胎丸粗多糖，以发育正常的斑马鱼为实验动物，研究粗多糖的抗氧化、免疫调节、造血等药理活性。（1）评价抗氧化活性。挑选24hpf（hours post fertilization）转基因（Tg(krt:NTR-hKiKGR)cy17）斑马鱼胚胎，设置溶剂对照组、模型组(甲硝唑组)、阳性对照组（甲硝唑+维生素C组）、滋肾育胎丸粗多糖组（甲硝唑+不同浓度的滋肾育胎丸粗多糖）。处理24h后，在荧光显微镜下观察，拍照，统计斑马鱼躯干部的荧光点数。（2）检测免疫调节活性。挑选48hpf转基因（Tg(Lyz:EGFP)）斑马鱼胚胎，设置溶剂对照组、模型组（长春瑞滨组）、滋肾育胎丸粗多糖组（长春瑞滨+不同浓度的滋肾育胎丸粗多糖），处理24h后，观察尾部中性粒细胞数目，评价多糖调节免疫功能效果。（3）评价促进造血功能活性。挑选48hpf野生型AB系斑马鱼胚胎，设置溶剂对照组、模型组（苯肼组）、滋肾育胎丸粗多糖组（苯肼+不同浓度的滋肾育胎丸粗多糖），处理24h后，进行邻联茴香胺染色，观察统计斑马鱼红细胞数量，评价多糖促进斑马鱼造血功能效果。 4.基于斑马鱼模型研究滋肾育胎丸早期胚胎发育毒性。通过观察死亡率、孵化率、形态学、运动行为能力等指标，初步评估其安全性。 结果： 1.通过检索TCMSP数据库中滋肾育胎丸15味中药材，共得到口服生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18的滋肾育胎丸化合物161个及其作用靶点1025个。检索GeneCards数据库中先兆流产疾病的靶点，得到1732个靶点。取二者交集得到324个滋肾育胎丸治疗先兆流产的靶点。构建了交集靶点的PPI可视化网络，经过进一步筛选得到41个关键靶点。通过GO和KEGG富集分析发现滋肾育胎丸在治疗先兆流产的功效主要与PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、VEGF通路、细胞凋亡等信号途径有关。 2.大鼠实验结果发现，与模型组相比，滋肾育胎丸处理组孕鼠的体重显著增加，E2和P的水平提高，子宫组织病理学检测显示先兆流产症状明显减轻。这表明滋肾育胎丸治疗可改善大鼠先兆流产模型的妊娠结局。分离各组大鼠子宫内膜组织，提取总RNA后，反转录，然后进行qRT-PCR检测，数据显示滋肾育胎丸通过调节PI3K/Akt、MAPK以及VEGF信号通路基因表达，减少炎症和凋亡的发生从而治疗先兆流产。 3.多糖被认为是中草药热水中的主要生物活性成分之一。利用热水回流提取技术获得滋肾育胎丸粗多糖，得率7.1%。甲硝唑通过氧化反应启动斑马鱼的凋亡反应。甲硝唑处理使转基因斑马鱼皮肤细胞凋亡，滋肾育胎丸粗多糖能够拮抗甲硝唑的促凋亡作用。1-10μg/mL滋肾育胎丸粗多糖有效改善甲硝唑引起的氧化损伤。化疗药物长春瑞滨诱导转基因斑马鱼免疫损伤，导致斑马鱼体内中性粒细胞减少，5-100μg/mL滋肾育胎丸粗多糖能拮抗长春瑞滨引起的免疫损伤，显著增加斑马鱼体内中性粒细胞，具有修复免疫系统损伤的保护作用。此外，苯肼处理诱导斑马鱼发生溶血性贫血，导致体内红细胞数量减少，10-100μg/mL滋肾育胎丸粗多糖拮抗后，显著增加斑马鱼体内红细胞数量，具有造血作用。 4.选择4hpf斑马鱼，与滋肾育胎丸共同孵育后，每天统计胚胎死亡数量和拍照记录形态变化，在第2-4天统计孵化胚胎数量，在第5天记录斑马鱼运动轨迹。根据存活率实验结果，我们选择了LC10以下的浓度进行早期胚胎发育评估，结果表明滋肾育胎丸对斑马鱼胚胎死亡率、孵化率、畸形率、形态、运动能力均没有显著影响，滋肾育胎丸对斑马鱼胚胎发育是安全的。 结论： 1.本研究采用网络药理学方法分析得到滋肾育胎丸通过多靶点、多通路干预先兆流产，其药理机制可能与PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路相关。 2.滋肾育胎丸可以增加孕鼠体重，促进母体发育，增加孕鼠血清中E2和P水平，减轻子宫组织病理变化，干预PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路过度激活，改善VEGF信号通路的紊乱，抑制炎症和细胞凋亡反应，从而治疗先兆流产。 3.滋肾育胎丸粗多糖具有抗氧化、免疫调节、造血活性。 4.滋肾育胎丸在100μg/mL浓度以下是安全无毒的。
NETL