摘要
目的：拓展鹿皮蛋白肽在免疫调节肽、抗血虚肽新药和保健食品开发领域的使用，针对鹿皮寡肽此方面的数据资料，优化筛选出鹿皮免疫活性成分并且对其活性组分进行辨识。 方法：以鹿皮为研究对象，利用系统溶剂法对鹿皮不同极性组分进行活性筛选，分别应用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、70%乙醇、纯水对鹿皮进行提取，以羟基自由基清除率、HS-5细胞增殖率、RAW264.7细胞增殖率、巨噬细胞RAW264.7细胞分泌一氧化氮的影响作为免疫活性的筛选指标，从而确定活性最佳的极性部位。选取最佳极性溶剂采用闪式提取法提取鹿皮的胶原蛋白溶液，使用膜分离技术分离为总提取、＞10KDa溶液，＜1KDa溶液以及其他分子量的鹿皮蛋白肽；以羟基自由基清除率、HS-5细胞增殖率、巨噬细胞增殖率、巨噬细胞分泌NO的影响作为免疫活性的确定参数进行筛选；使用水解度及羟脯氨基含量为考察指标，采取响应曲面法优化酶解鹿皮的具体方法条件。为进一步确定鹿皮免疫调节、补血的有效部位，利用葡萄糖凝胶柱色谱Sephadex G-25对鹿皮活性成分分离，并通过LC-ESI-MS/MS推测其可能的化学结构，采用MTT法评价其免疫及补血活性，进一步辨识鹿皮中的主要活性成分。 结果：通过系统溶剂法并且以羟基自由基清除率、HS-5细胞增殖率、巨噬细胞增殖率、巨噬细胞分泌NO的影响作为活性的指标参数筛选出鹿皮不同极性组分活性大小结果表明水层略优于其他几个组分，故接下来选取水层继续进行下一层次的探索。分别经过各部位的免疫活性和补血活性的的研究比较，实验数据说明各组分对免疫细胞各项指标综合活性由大到小依次为：酶解小于1KDa、＜1KDa、1-3KDa、3-10KDa、＞10KDa，其中酶解小于1KDa部分、小于1KDa部分试样的增强免疫力的作用都具备明显差异，筛选得出鹿皮寡肽为免疫调节活性最佳部位。采取响应曲面法最终确定了最适合酶法提取条件参数是：水解温度60℃、水解时间为6h、pH=9、酶与底物比例5%，羟脯氨酸含量预估响应值是6.48%，水解度预估响应值是46.09%，其中加酶量这一因素对水解效果的影响较为最大，其次是pH数值，最后是水解时的温度。通过LC-ESI-MS/MS推测其可能的化学结构，目前确定了其中的8个寡肽的氨基酸序列，寡肽DT1的氨基酸序列确定是：NH2-Asp-Asn-Val-COOH，寡肽DT2的氨基酸序列是NH2-Met-Asp-Ser-COOH，寡肽DT3的氨基酸序列确定是NH2-His-Asn-COOH。酶解寡肽的氨基酸序列确定是：寡肽DM1的氨基酸序列确定是NH2-Arg-Arg-COOH，DM2的氨基酸序列确定是NH2-Ser-Try-COOH或NH2-Asn-Pro-Met-COOH或NH2-Arg-Met-Ile/Leu-COOH，DM3的氨基酸序列确定是NH2-Arg-Ile/Leu-COOH。 结论：鹿皮寡肽具有显著的免疫调节及治疗血虚的药理活性，并筛选了活性部位＜1KD组分，经分离鉴定分析出8种鹿皮寡肽。通过对RAW264.7细胞、骨髓造血细胞SH-5研究其对免疫调节、骨髓造血细胞SH-5的造血功能的相关作用影响，为鹿皮免疫调节肽、抗血虚肽产品开发提供参考，为其在新药开发领域提供理论基础。
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