摘要
牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)是引起犊牛和育肥牛急性呼吸道综合征的主要病原之一，呈世界流行，给养牛业造成了巨大的经济损失。2018年，黑龙江省多个牛场4-10月龄犊牛发生急性呼吸道传染病疫情，发病率27.42％(329/1200)，死亡率高于25％(85/329)。利用高通量测序技术，对采集的病死牛肺脏样本中的微生物多样性进行了综合分析，初步确定引起此次疫情的病原为BRSV，通过细胞分离培养获得了稳定传代的病毒株，命名为BRSV DQ株，并采用RT-PCR和间接免疫荧光方法对分离的BRSV DQ毒株进行了鉴定;通过对BRSV DQ毒株的遗传进化分析，确定该分离毒株属于BRSVⅢ型，这是我国首次报道该亚型BRSV的存在;建立了BRSV实时RT-PCR检测方法，并基于建立的方法进行了BRSV的流行病学调查。 本研究的具体内容如下: 第一部分，BRSV DQ株的分离鉴定。采用高通量测序对采集的患病牛肺脏组织中的微生物多样性进行分析，结果显示，牛正肺炎病毒(Bovine orthopneumovirus)即BRSV的丰度占27.23％，显著高于其他微生物丰度，因此推测发生的犊牛急性呼吸道传染病疫情主要由BRSV引起，将该病毒命名为BRSV DQ株;参考GenBank中发布的BRSV基因序列设计引物，采用RT-PCR方法对病料进行鉴定，检测结果显示为BRSV阳性;将病料用液氮研磨，加入DMEM培养液重悬，经离心、过滤后，将滤液接种MDBK细胞，进行体外传代培养，结果显示，感染细胞产生稳定的CPE，采用RT-PCR方法检测P5-P11代细胞培养物，结果均显示BRSV阳性;利用制备的鼠源抗BRSVN蛋白多抗，通过间接免疫荧光方法检测MDBK细胞繁殖的BRSV，结果显示，接种病毒组MDBK细胞有特异性绿色荧光，MDBK细胞对照组未见荧光，表明制备的多抗血清可特异性识别BRSV;细胞超薄切片电镜观察结果显示，病毒粒子呈球形，直径大小约100-150nm左右，病毒表面有刺突。综上结果，本研究成功鉴定并分离出BRSV DQ株。 第二部分，BRSV DQ毒株的遗传进化分析。利用MEGA7.0软件对BRSV DQ毒株全基因组序列以及各基因序列进行遗传进化分析:其中，BRSV分型主要依据其G基因序列，基于G基因的遗传进化分析显示，BRSV DQ株与USⅡ/S1、15489、V41和NY487834毒株的遗传关系最近，均属于BRSVⅢ型;此外，基于BRSV全基因组序列以及病毒各蛋白编码基因F、SH、M、M2-1、M2-2、P、L、N、NS1和NS2的遗传进化分析结果均显示，BRSV DQ株与BRSVⅢ型USⅡ/S1毒株的亲缘性最近。以上结果证实，本研究分离的BRSV DQ毒株属于BRSVⅢ型，这是国内首次报道Ⅲ型BRSV毒株的存在。 第三部分，BRSV实时RT-PCR检测方法的建立与应用。以BRSV的N基因为靶基因，针对Ⅰ-Ⅶ型BRSV的N基因共同保守区域设计引物，建立了BRSV实时RT-PCR检测方法;该检测方法的特异性强，仅BRSV为阳性;该方法的检测灵敏度高，最低检出限为101copies/μL，显著高于常规RT-PCR方法;利用建立的方法对从黑龙江省内采集的68份牛鼻腔拭子和肺脏样本进行检测，结果显示，BRSV阳性检出率为27.94％。BRSV实时RT-PCR检测方法的建立为BRSV流行病学调查提供了技术支撑。
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