摘要
阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter.sakazakii)，是一种无芽孢，兼性厌氧的革兰氏阴性肠杆菌。作为一种条件性致病菌，其能够引起新生儿严重的脑膜炎、坏死性结肠炎和菌血症等疾病，导致较高的死亡率(40％～80％)和严重的神经系统损伤后遗症，以及发育障碍。由于其广泛存在于各类食品及食品加工环境，因此严格防控食品中的阪崎克罗诺杆菌污染显得尤为必要。噬菌体具有宿主特异性，多数情况针对一种或几种宿主菌，高效杀死特定菌株的同时不会危害到食品中或肠道内的有益菌群。且噬菌体可以有效地裂解存在于细菌生物膜中的细胞，这支持其作为防控生物膜相关感染的一种有效手段。因此，噬菌体及其衍生物己成为一种新颖、可行且安全的选择，用于预防或根除各种食品及其加工环境中多种污染物。 本课题以C.sakazakii ATCC29544为宿主菌，在阪崎克罗诺杆菌原生环境中分离阪崎克罗诺杆菌噬菌体，对其形态学表征及生物学特性进行研究。通过评价噬菌体对宿主菌的生长抑制作用，筛选出抑菌活性最佳的噬菌体JK004。利用全基因组测序技术分析噬菌体JK004基因组信息，并通过抑菌应用试验对噬菌体JK004抑菌作用进行评价。通过上述研究得到如下结果:(1)共分离得到5株阪崎克罗诺杆菌噬菌体。通过对面粉工厂中的成品与半成品进行采样，以C.sakazakii ATCC29544为宿主菌，分离得到5株阪崎克罗诺杆菌噬菌体，分别命名为JK001、JK002、JK003、JK004、JK005。5株噬菌体的噬菌斑为圆形，中间透亮，无晕环，符合烈性噬菌体特征，直径大小约为1-2.2mm。通过透射电镜观察，5株噬菌体均具有典型的二十面体头部，可收缩性尾部，属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科。 (2)评价了5株噬菌体的生物学特性。噬菌体宿主范围结果显示5株噬菌体均只能裂解C.sakazakii ATCC29544。5株噬菌体的最佳感染复数分别为0.1、0.01、0.1、0.01、0.1;对宿主菌的吸附率分别为82％、89％、90％、95％、81％。一步生长曲线显示5株噬菌体潜伏期分别为10min、10min、20min、20min、10min;爆发期分别为50、40、50、40、20min;稳定期分别为60min、70min、50min、60min、90min;裂解量分别为16.5pfu/infected cell、208pfu/infected cell、134pfu/infected cell、138pfu/infected cell、15.3pfu/infected cell。 (3)5株噬菌体具有良好的耐热，耐酸碱能力与盐耐受性。研究不同理化条件对噬菌体的活性影响显示，5株噬菌体在30℃-40℃效价基本保持不变，在50℃-70℃持续下降，80℃完全失活。在pH值为6-8时效价相对稳定，当偏酸或偏碱时，效价逐渐降低。当pH≤2或≥10时，完全失去活性。5株噬菌体中的4株在10％NaCl溶液中作用72h仍能保持4log以上的效价。 (4)噬菌体JK004具有较高的抑菌活性。5株噬菌体对宿主菌的生长抑制作用结果显示，抑菌时长分别为3h、4h、3h、5h、3h;OD600减少量为0.063、0.112、0.099、0.164、0.083。其中噬菌体JK004抑菌时长最长，OD600减少量最多，抑菌效果显著高于其他噬菌体。因此，选取噬菌体JK004作为后续研究对象。 (5)明确了噬菌体JK004的基因组学信息。利用全基因组测序技术，得出噬菌体JK004遗传物质为双链DNA，全长为93825bp，GC平均含量为32.86％，基因组成环，共预测到了125个编码基因，编码基因长度为84840bp，基因平均长度为679bp，共占全基因组的90.42％。基因组注释结果表明并没有在噬菌体JK004基因中不含有已知毒力基因或转导基因，说明噬菌体JK004具有潜在的安全性和实际应用价值，并通过共线性分析推断其为Punavirus属。 (6)噬菌体JK004具有良好的抑菌效果。噬菌体JK004可有效抑制阪崎克罗诺杆菌生物膜的形成，作用48h时，生物膜抑制率高达87％;能有效清除附着在聚乙烯、橡胶、不锈钢材料上的阪崎克罗诺杆菌，在作用6h后，相比于对照组，附着在不同材料表面的阪崎克罗诺杆菌分别降低了3.33log、3.32log、2.79log;能够有效抑制阪崎克罗诺杆菌在复水婴幼儿配方乳粉中的生长，在4℃条件下作用16h后，宿主菌数量明显降低，在37℃条件下作用2-4h后，12h内均无法检出阪崎克罗诺杆菌。
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