摘要
工业排放导致重金属污染严重，可在生物体内积累，也可通过食物链的连锁反应，逐步积累到人体，对生态环境和人体健康构成严重威胁。在各类重金属中，镉毒性最强且分布广泛，对人体危害大。镉离子在体内可通过促DNA异常甲基化、抑制DNA修复、诱导氧化应激、影响细胞周期调控、抑制细胞凋亡等多个途径导致肿瘤增生。前期研究发现丝状真菌不仅能吸附重金属，其发酵液还对肿瘤细胞有抑制作用。但由于已有报道的丝状真菌对重金属的吸附量低，发酵液对肿瘤细胞的抑制率低，导致丝状真菌在生物医用领域的应用受到限制。据此，本文拟开展对镉耐受性强的真菌—球孢白僵菌的筛选研究，基于RNA转录组测序考察菌体的镉离子吸附机制；探究丝状真菌在抵御和吸附重金属镉过程的基因调控变化规律，揭示发酵液对肿瘤细胞的抑制响应，以及菌体吸附特性和肿瘤细胞抑制率之间的互作关系，旨在进一步拓展药用真菌在生物医疗领域的应用价值，主要研究结论如下： 1、研究了高抗镉球孢白僵菌的筛选及对重金属吸附特性。从重金属污染土壤中筛选得到一株耐镉丝状真菌，通过对菌株ITS序列的比对，确定该菌株为球孢白僵菌Beauveriabassiana，命名为Z1。对菌株Z1进行镉耐受性测定，结果表明该菌株在含Cd2+为9000mg/L的平板上仍能生长，远高于已报道的耐镉芽孢杆菌3900mg/L的耐镉浓度。考察了菌株Z1在液体培养条件下对Cd2+吸附能力。结果表明，该菌株在浓度20mg/L~100mg/L和200mg/L~1000mg/L均表现出对镉离子的高效吸附性：菌株Z1在含镉40mg/L的液体培养基中，吸附率可达到97.4%；在Cd2+浓度高达1000mg/L时，吸附率可达到92.1%。 2、研究了高浓度Cd2+胁迫下球孢白僵菌的高效吸附机理。通过Illumina测序技术分析其在Cd2+胁迫下转录组学的变化，从mRNA水平研究了菌株Z1对镉的适应机制。通过差异基因的注释和相关功能分析，筛选与重金属抗性有关的基因，获得两组间差异表达的基因共有2022个，其中有1104个基因的表达量相较于对照组表现为上调，918个基因的表达量表现为下调。通过差异表达基因进行GO和Pathway富集分析发现，这些基因主要富集在7077个GO条目和3716个KEGGPathway中。其中，活性氧的表达清除酶基因和重金属抗性基因(P型ATP转移酶、重金属耐受性蛋白、细胞色素P450等)是菌株Z1具有高镉耐受性的主要基因。在表达差异显著的基因中选取过氧化氢酶基因和细胞色素P450基因进行荧光定量PCR实验。结果表明，在重金属Cd2+胁迫下，基因CAT和CPY450的表达量均呈上调趋势，与转录组的结果一致。 3、研究了菌体吸附特性与发酵液肿瘤细胞抑制率的互作关系。对2000mg/L镉离子驯化过的菌株Z1进行深层发酵，将发酵液的乙酸乙酯部位进行萃取，并考察其对乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果。在乙酸乙酯部位浓度10~150μg/mL范围内，球孢白僵菌乙酸乙酯部位对乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果明显，在处理时间24h后，乙酸乙酯部位浓度为50μg/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7抑制效果最好，抑制率达到48.13%，远高于文献中的抑制率，初步证明球孢白僵菌的耐镉性与肿瘤抑制率相关。
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