三七不同生育期根际土壤微生物组研究

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中文摘要：根际微生物在植物生长、营养获取和抵抗病原微生物入侵中起着重要的作用。植物能够影响根际微生物的多样性、组成、结构和功能。同时，植物的生长阶段也影响着根际微生物。根际微生物与作物的产量和品质密切相关。然而，多年生药用植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]不同生育期根际微生物的多样性、组成和结构是如何演替的？收获期作为三七生育周期中的最后一个时期，这个时期根际微生物的多样性、组成和功能是怎样的？收获期根际微生物的群落和功能与三七的产量又有怎样的关系？这些问题目前尚缺乏系统的研究。为了研究三七不同生育期根际土壤微生物的动态变化，在三七主产区(云南省文山州)的平坝(Pingba: PB)，砚山(Yanshan: YS)和丘北(Qiubei: QB)实验点进行三七不同生育期实验，其中平坝设有三个实验点，分别为平坝A(PBA)、平坝B(PBB)和平坝C(PBC)。简单的说，一年生的三七苗子移栽在实验田中，在固定的小区生长两年直到收获。三七的种植严格按照GAP操作规程进行。收集三七不同生育期的根际土壤样本，移栽前的大田土壤作为对照土壤(Bulk soils：BL)。三七每年都有一个完整的生育期，包括：营养生长期(5月)、花期(7月)以及根部生长期(10月)。收集两年和三年生三七的营养生长期、花期以及根部生长期的根际土壤，分别命名为2YV(2-year vegetative stage)、2YF(2-year flowering stage)、2YR(2-year root growth stage)、3YV(3-year vegetative stage)、3YF(3-year flowering stage)和3YR(3-year root growth stage)。连续两年收集三七6个生育期的根际土壤样本，共获得90份根际土壤，15份对照土壤BL。对105份土壤样本的DNA进行扩增子测序，通过对数据的分析探索三七不同生育期根际土壤微生物的多样性、组成和结构的演替特性。通过宏基因组测序研究三七收获期根际土壤微生物的功能；最后通过相关性分析筛选与三七产量相关的根际微生物群落和功能性状。主要结果如下： (1)三七不同生育期根际土壤微生物αlpha多样性的演替模式运用richness和Shannon评价三七不同生育期根际土壤αlpha多样性。带有二次项的最小二乘法回归分析表明：随着三七的生长，根际土壤细菌和真菌的αlpha多样性在整个生育期呈现相似的抛物线式的变化。三七整个生育期根际细菌和真菌αlpha多样性指数呈现先增长后降低的趋势。与对照土壤BL相比，根际细菌和真菌群落的αlpha多样性指数显著增长。相比于3YF阶段，真菌和细菌群落的αlpha多样性指数在3YR阶段显著降低。 (2)三七收获期根际土壤微生物群落较其他生育期活跃冗余分析结果表明：生育期是影响根际土壤微生物的主要因素。约束柱坐标分析结果表明：三七不同生育期根际土壤样本能够与对照土壤样本分开，3YR时期的根际土壤样本与其他生育期区分开。根际土壤与非根土壤的Bray-Curtis距离随着三七的生长而增加。细菌和真菌属水平的差异丰度分析结果表明：三七根际土壤细菌和真菌群落的富集和排斥活动在3YR时期较其他生育期活跃。每个生育期与对照土壤相比(属水平的差异丰度分析)，随着三七的生长更多的细菌属发生富集和排斥，其中在2YV到3YR阶段有159个细菌属的丰度保持持续显著增长，同时128个细菌属的丰度保持持续显著降低。相反，随着三七的生长较少的真菌属发生富集，438个真菌属中有82个的属的丰度没有显著变化。每个生育期与前一个生育期(属水平的差异丰度分析)结果显示：细菌群落例如Dyadobacter、Dysgonomonas、Burkholderia、Delftia、Lechevalieria和Hyphomicrobium在3YR阶段富集。同时，3YR阶段也富集了一些真菌群落Cladosporium、Epicoccum、Phoma、Exophiala、Fusarium和Ilyonectria。 (3)三七不同生育期根际土壤微生物网络结构的变化基于图度分布距离的多维尺度分析结果显示:细菌和真菌的群落决定了细菌和真菌拥有不同的网络结构(Anosim,R=0.97,P＜0.001)。通过三七不同生育期根际土和对照土的细菌和真菌网络节点数和边数目可知，细菌和真菌根际土的共发生网络远大于对照土。细菌和真菌不同生育期共发生网络的节点数和边数在整个生育期呈现先增长后持续降低的趋势。三七不同生育期根际土壤细菌和真菌共发生网络的模块性和平均路径长度低于对照土。随着三七的生长根际土壤细菌共发生网络的模块性和平均路径长度稍微低于对照土，而真菌的根际土壤微生物共发生网络的模块性和平均路径长度显著性低于对照土。 (4)三七收获期根际土壤微生物多样性、组成和功能通过对收获期产量存在显著差异的根际土壤样本的宏基因组测序，解析三七收获期产量差异的根际土壤微生物多样性、组成和功能。基于宏基因组的数据在门、纲、目、科和属的水平进行alpha多样性分析，结果表明：αlpha多样性指数在5个实验点存在差异；YS和QB的αlpha多样性指数Shannon在门、纲、目和科水平显著高于PBA、PBB和PBC。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析表明：YS和QB在群落组成上区别于PBA、PBB和PBC(Adonis:R2=0.42,P=0.001)。门水平的群落组成分析表明：酸杆菌门(Actinobacteria)的相对丰度在YS和QB显著高于PBA、PBB和PBC。一共1,330,812基因注释到了KEGG数据库，获得4,436个KEGGorthology(KO)功能类别。KO主要涉及6个KEGGlevel1和43个KEGGlevel2途径。在KEGGlevel1水平上，细胞过程(cellular processes)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)和人类疾病(human diseases)的相对丰度在PBA的根际微生物中显著高于PBB、PBC、YS和QB(P＜0.05)。在KEGGlevel2水平上，次生代谢物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)、抗药性(drug resistance)、环境适应(environmental adaptation)、多糖生物合成和代谢(glycan biosynthesis and metabolism)、辅酶因子和维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins)和膜转运(membrane transport)的相对丰度在PBA的根际土壤微生物中显著高于PBB、PBC、YS和QB(P＜0.05)。脂类代谢(lipid metabolism)的相对丰度在QB的根际土壤微生物中显著高于PBA、PBB、PBC和YS(P＜0.05)。在KO水平上，基于Bray-Curtis距离的主坐标分析表明：5个实验点的KO存在差异(Adonis:R2=0.42,P=0.001)。KO涉及细菌分泌系统(bacterial secretion systems)、鞭毛组装(blagella assembly)、细菌趋向性(bacterial chemotaxis)、双组分系统(two-component system)、植物与病原互作(plant-pathogen interaction)以及ABCtransporters(ABC转运蛋白)等植物与微生物互作以及微生物与微生物互作的途径，在5个实验点的根际土壤中有较高的相对丰度。 (5)根际土壤微生物组与三七产量具有相关性三七收获期根际土壤微生物群落和功能性状与三七的产量进行皮尔森相关性分析。在细菌属水平，三七收获期根际微生物中细菌属与三七产量相关性系数|R|＞0.5的为127个，其中正相关的属为63个，负相关的属为64个。Acidothermus、Aquicella、Caenimonas、Crossiella、Hydrogenispora、Lysinibacillu、Sporichthya和Sporosarcina与三七的产量显著性相关(P＜0.05)。三七收获期根际微生物中真菌属与三七产量相关性系数|R|＞0.5的属为57个，正相关的属为26个，负相关的属为31个。Aspergillus、Leptosphaeria和Preussia与三七的产量显著性相关(P＜0.05)。在KEGGlevel3的水平上，85个功能性状与三七产量显著性相关(P＜0.05)，其中12个功能性状与三七产量正相关，73个功能性状与三七产量负相关。功能性状，例如类固醇生物合成(steroid biosynthesis)和MAPK信号途径(MAPK signaling pathway)与三七的产量正相关；相反，功能性状例如：细菌分泌系统(bacterial secretion system)、ABC转运蛋白(ABC transporters)、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)以及药物代谢中的细胞色素P450(drug metabolism–cytochrome P450)与三七产量负相关。我们的研究结果揭示了生育期是影响三七根际土壤微生物变化的一个重要因素；在三七的整个生育期根际微生物中细菌和真菌多样性的演替呈现相似的抛物线模式。三七收获期根际土壤微生物的富集和排斥较其他生育期活跃。三七的种植降低了根际土壤微生物共发生网络的稳定性。三七收获期根际土壤微生物群落和功能性状与三七产量密切相关。

作者：

李孟芝

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关键词：

三七根际土壤生育期根际微生物宏基因组功能性状

授予学位：

博士

学科专业：

中药学

导师：

陈士林

学位年度：

2020

学位授予单位：

湖北中医药大学

语种：

中文

中图分类号：