摘要
目的： 1.观察抗纤软肝颗粒(KXRG)对肝纤维化患者的临床疗效及对肠道菌群的调控作用，为KXRG抗肝纤维化提供循证医学证据。 2.观察KXRG对CCl4诱导的肝纤维化小鼠肠道菌群、肠黏膜屏障及肝组织炎症免疫相关通路的影响。随后建立伪无菌小鼠模型，将KXRG组小鼠粪菌移植到伪无菌小鼠体内，观察KXRG是否通过改善肠道菌群影响肝内免疫及炎症相关因子，进一步探讨KXRG防治肝纤维化的作用机制，以期能为KXRG防治肝纤维化提供新的研究视角和作用靶点。 方法： 1.采用临床回顾性研究方法，研究KXRG对乙肝肝纤维化患者的临床疗效与肠道菌群的影响。80例乙肝肝纤维化患者分为两组，对照组(36例)患者使用恩替卡韦(ETV)治疗，治疗组(44例)使用ETV联合使用中药KXRG治疗，干预时间为6个月，比较两组患者治疗前后的肝功能、肝脏硬度值(LSM)，并用16SrRNA技术比较治疗后两组患者的肠道菌群变化情况。 2.采用40%CCl4橄榄油溶液间断性皮下注射8周，建立肝纤维化小鼠模型，予以KXRG水溶液(3.9g/kg)灌胃治疗。8周后，观察正常组、模型组、KXRG组小鼠体重，肝脏指数，肝功能及肠道、肝脏病理学变化；运用16SrRNA测序检测各组小鼠肠道菌群变化；运用酶联免疫吸附法检测LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α表达；运用免疫组织化学法和RT-qPCR检测各组小鼠肠道紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白及基因表达；运用免疫印迹法和RT-qPCR检测肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及基因表达。 3.予以肝纤维化小鼠混合抗生素(氨苄西林1g/L、万古霉素0.5g/L、硫酸锌霉素1g/L、甲硝唑1g/L)灌胃7天，构建伪无菌小鼠模型，运用FMT将正常组、模型组、KXRG组的小鼠粪菌混悬液以200μl/只进行灌胃移植至正常组小鼠粪菌移植组(FMT-control)、模型组小鼠粪菌移植组(FMT-model)、KXRG组小鼠粪菌移植组(FMT-KXRG)，以未处理的C57BL/6小鼠为空白对照组(Control)，观察各组小鼠体重、肝脏指数、肝功能及肠道、肝脏病理学变化；运用酶联免疫吸附法检测LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α表达；运用免疫组织化学法和RT-qPCR检测各组小鼠肠道紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白及基因表达；运用免疫印迹法和RT-qPCR检测肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及基因表达。 结果： 1.临床研究结果：KXRG对乙肝肝纤维化患者临床研究共收集病例80例，其中男36例，女44例，年龄18-65岁，治疗组44例，对照组36例。 (1)两组患者性别、年龄、病程时间差异及治疗前肝功能肝脏硬度值差异无统计学意义(P＞0.05)。 (2)KXRG对乙肝肝纤维化患者肝功能影响的结果显示：经过6个月治疗，两组患者ALT、AST、GGT、TBIL均较治疗前下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；对治疗后的两组患者ALT、AST、TBIL、GGT行组间比较，治疗组肝功能指标下降情况较对照组显著(P＜0.05)。 (3)KXRG对乙肝肝纤维化患者LSM影响的结果显示：对两组治疗前后进行组内比较，对照组在治疗前后的LSM差异无统计学意义(P＞0.05)，而治疗组的LSM在治疗后较治疗前明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 (4)KXRG对乙肝肝纤维化患者肠道菌群影响的结果显示：与对照组相比，治疗组OTU数量明显增加(P＜0.05)；与对照相比，治疗组Chao1指数、Observedspecies指数、Shannon指数以及Simpson指数显著增高(P＜0.05)；PCoA及UPGMA样本间层次聚类分析显示两组样本界限明显。菌群结构及丰度分析显示，在门水平上，与对照组相比，治疗组拟杆菌门丰度明显升高，变形菌门、梭杆菌门丰度显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；在科水平上，与对照组比较，治疗组在毛螺菌科、拟杆菌科丰度明显升高，肠杆菌科、梭杆菌科、韦荣氏菌科、链球菌科丰度显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；在属水平上，与对照组相比，治疗组双歧杆菌属、拟杆菌属、毛螺菌属丰度明显升高，埃希菌属、韦荣球菌属、梭杆菌属丰度显著降低(P＜0.05)。基于KEGG数据库和COG数据库，对两组差异菌群进行功能预测，发现与肠道感染、细胞凋亡、上皮细胞的细菌入侵、脂多糖的生物合成、初级胆汁酸的生物合成、mTOR信号通路、脂肪酸代谢、紧密连接、胆汁分泌、转录相关因子、VEGF信号通路、抗原的处理与提呈、内质网的蛋白加工、细菌毒素、ECM与受体的相互作用、昼夜节律、p53信号通路等301种生物功能相关。 2.实验研究第一节结果显示： (1)与正常组相比，模型组小鼠体重明显下降，肝脏指数上升，ALT、AST表达明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，KXRG组小鼠体重明显上调、肝脏指数下调，肝功能指标ALT、AST表达下调(P＜0.05)。 (2)KXRG可以改善CCl4导致的小鼠肠道菌群紊乱。模型组与KXRG组在OTU指数、Alpha多样性、Beta多样性存在差异。体现菌群差异的LEfSe分析显示，与模型组相比，KXRG组脱铁杆菌门、GCA_900066575、脱铁杆菌科、Coriobacteriia、Coriobacteriaceae_UCG_002、脱铁杆菌目、红蝽菌目、Atopobiaceae、Mucispirillum、Faecalibaculum的丰度明显降低，芽孢杆菌目、葡萄球菌科、葡萄球菌属、凸腹真杆菌属、普雷沃氏菌属、红游动菌属、Paenalcaligenes、产液阿德勒克罗伊茨菌丰度明显增加。 (3)与正常组相比，模型组小鼠结肠组织病理学改变无明显改变，但肠道紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达水平下调(P＜0.05)；与模型组相比，KXRG组小鼠肠道Claudin-1、Occludin、ZO-1表达上调(P＜0.05)。 (4)与正常组相比，模型组小鼠肝脏损害和胶原纤维化沉积明显，血清内毒素LPS、炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显上调(P＜0.05)，肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白和基因表达上调(P＜0.05)；与模型组相比，KXRG组小鼠肝组织损伤及胶原沉积减轻，LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α表达下调(P＜0.05)，肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白和基因表达下调(P＜0.05)。 3.实验研究第二节结果显示： (1)与Control组相比，FMT-model组AST、ALT、HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ表达明显升高(P＜0.05)；与FMT-model组相比，FMT-control组、FMT-KXRG组小鼠AST、ALT及HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ表达明显下调(P＜0.05)。 (2)与Control组相比，FMT-model组结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达水平明显下降(P＜0.05)；与FMT-model组相比，FMT-control组、FMT-KXRG组小鼠结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达水平明显上调(P＜0.05)。 (3)与Control组相比，FMT-model组小鼠炎症及胶原纤维增生明显，LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显上调(P＜0.05)，肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白与基因表达明显上调(P＜0.05)；与FMT-model组相比，FMT-control组、FMT-KXRG组小鼠肝组织炎症及胶原沉积有所改善，内毒素LPS及细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平下调(P＜0.05)，肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及基因表达也显著下降(P＜0.05)。结论： 1.KXRG可以改善乙肝纤维化患者肝功能及肝脏硬度值，同时可以调节患者肠道菌群的结构与丰度。 2.KXRG可以通过调节CCl4诱导的肝纤维化小鼠肠道菌群结构，改善肠道黏膜屏障功能，下调肝TLR4/MyD88/NF-κB通路，改善肝内炎症及胶原沉积，影响肝纤维化进程。
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