摘要
一、研究背景 强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一种遗传相关性显著的慢性自身免疫性疾病。目前，AS没有公认的特异性标志物，其发病机制尚不十分清楚。经流行病学调查，中国约有0.3%的人口罹患此病，患者群体数量庞大。AS多始发于20至40岁的中青年，起病隐匿，它以骶髂关节慢性进行性炎症为始发症状和主要特征。炎症病变常向上蔓延至中轴骨骼、向下累及外周关节，晚期则可导致脊柱或髋关节周围软组织纤维性或骨性融合，甚至造成严重的身体畸形和残疾，给病患及其家庭带来了巨大的痛苦。强直性脊柱炎的发病机制虽然在过去二十年里已经在世界范围内进行了广泛而深入的研究，但人们对其炎症和骨化的发病机制及相互关系仍没有形成统一认识。同时，AS的临床治疗一直未有突破性进展，公认疗效最好的生物制剂(肿瘤坏死因子(Tumournecrosisfactor-α，TNF-α)抑制剂)虽然能够短期缓解部分人群的临床症状，但对于有效阻止病人晚期骨化强直并不理想。 AS病变部位一旦累及脊柱及外周关节，病人生活质量将大大下降。因此深入了解这些部位病理环境的微观构成和细胞之间的生物学行为更有助于我们理解AS的发病机制，也为药物开发提供有价值的作用靶点。到目前为止，人们对AS炎症和骨化的关系观点不一。AS韧带局部病理微环境中有哪些细胞构成以及他们发挥的功能也未见报道。因此，本课题利用单细胞转录组学测序，对AS脊柱韧带附着点微环境中各种细胞的亚群构成和交互形式进行分析。并通过体内、体外两种方式深入探讨以巨噬细胞为代表的炎症细胞和具有成骨分化潜能的韧带来源干细胞之间交互的分子机制，探索了AS中炎症和骨化间的关系。 二、研究目的 第一部分：通过对强直性脊柱炎脊柱附着点处韧带进行单细胞转录组学分析找到与炎症和骨化相关的细胞交互类型并且对关键分子进行表达量的验证。 第二部分：探究强直性脊柱炎脊柱韧带微环境中巨噬细胞影响韧带来源干细胞成骨分化进程和细胞迁移的机制。 第三部分：验证VEGFA靶向VEGFR2受体介导异位成骨的体内、体外机制。 三、研究方法 第一部分：(1)收集了5例脊柱矫形的AS病人和3例脊柱骨折的健康对照者的相同腰椎节段棘上韧带、棘间韧带和黄韧带附着点组织，制作单细胞悬液，基于BDRhapsody技术在全程质控下对收集的细胞进行单细胞转录组学测序。(2)利用生物信息学手段处理了单细胞转录组学结果，着重探究脊柱韧带附着点部位病理性微环境中的细胞亚群构成，并重点分析了与AS炎症和骨化表型相关的细胞之间的交互关系及靶信号分子，并对靶分子在疾病组和对照组目的细胞中的表达进行差异分析。(3)采集AS和正常人的血清、单核细胞和腰椎骨折病人的腰椎韧带组织，并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学(IHC)技术对靶分子VEGFA表达量进行了检测。 第二部分：(1)选取AS和腰椎骨折病人腰椎附着点处韧带组织切片，用免疫荧光(IF)的方法对巨噬细胞及VEGFA进行标记，并对他们的表达量和相关性进行分析。(2)对人外周血单核细胞进行M2方向的诱导，选取CD14、CD206作为标记基因对其进行流式细胞术鉴定；选取CD73、CD90、CD105、CD14、CD34和CD45作为标记基因，对提取的韧带间充质干细胞进行流式鉴定。(3)设计不同浓度TNF-α(0、5、20ng/ml)对AS的M2巨噬细胞进行干预，通过RT-qPCR和ELISA检测VEGFA的表达量。(4)对AS和对照组腰椎韧带干细胞同时行成骨诱导分化，分别在诱导分化7天行碱性磷酸酶(ALP)染色和活性定量，21天行茜素红染色和钙结节定量，对比其成骨分化能力。(5)选取上述实验中的最佳浓度TNF-α(20ng/ml)刺激后的M2巨噬细胞培养上清，并将实验分为对照组(只成骨诱导)、TNF-α刺激组和TNF-α刺激+VEGF抑制剂组，对成骨分化培养过程中的AS韧带干细胞进行干预，培养7天后进行ALP染色及活性检测；RT-qPCR检测ALP、Runx2、COL1A1三种成骨指标表达量以反映三组细胞成骨分化情况。(6)设计不同浓度下VEGFA的刺激实验对成骨分化诱导过程中的AS韧带干细胞进行干预，在3天、7天进行ALP染色和活性定量；9天、14天进行茜素红染色和钙结节定量；并使用RT-qPCR的方法检测成骨相关指标表达量，检验其促成骨的能力。(7)利用单细胞测序结果，通过GO分析对AS韧带干细胞中VEGFA受体相关富集基因进行分析，对得到的GO功能和关联基因网络进行ClueGO可视化，并深入挖掘VEGFA对AS韧带干细胞刺激后激活的胞内信号分子和相关通路。(8)VEGFA调控AS韧带干细胞成骨分化的分子机制的探究：荧光共定位标记AS韧带切片的VEGFA和其功能性靶受体(VEGFR1、R2、R3)，对它们的共定位进行检测；选取3例AS组和3例对照组韧带干细胞在VEGFA刺激下同时进行成骨诱导，使用WesternBlot检测各个受体激活的程度；设计不同时间梯度下VEGFA对成骨分化进程中AS韧带干细胞的刺激实验，通过WesternBlot验证激活通路的组学分析结果；通过目标通路和目标受体的抑制试验，并结合ALP染色及活性检测、茜素红染色和钙结节定量的成骨能力检测，对上述VEGFA介导成骨的分子机制进行进一步验证。(9)将实验分为对照组(加入等量DMSO溶剂)、单纯VEGFA刺激、单纯Ki8751(靶受体VEGFR2抑制剂)干预和Ki8751干预后VEGFA刺激组，通过迁移小室检测VEGFA对AS韧带干细胞迁移能力的影响。 第三部分：(1)选取并构建VEGFA稳定干扰的U937细胞系，设计不同分组，通过与AS腰椎韧带干细胞共培养的方式验证巨噬细胞通过VEGFA介导韧带干细胞成骨分化的交互关系。(2)构建由人软骨蛋白聚糖诱导的AS小鼠模型(PGIA)，分离脊柱及周围组织并制作组织切片，应用小动物X线、苏木精-伊红染色(HE染色)、番红-固绿染色对脊柱进行摄片和病理染色，检验模型构建的成功与否。(3)通过IHC染色、ELISA检测AS小鼠模型和正常对照组脊柱关节盘及其周围组织和血清中VEGFA的表达。(4)对AS小鼠模型行Ki8751(VEGFR2抑制剂)干预实验：实验共分3组，分别是阴性对照组(抑制剂溶剂注射)、早期抑制剂干预组(实验进程0周开始干预)、中期抑制剂干预组(实验进程10周开始干预)。探究抑制AS小鼠动物模型VEGF受体信号对脊柱异位骨化和破坏的影响，以及对比不同干预时程的疗效。(5)选取成骨相关转录因子(Osterix)作为成骨细胞标记分子，选取CD44、CD90为干细胞标记分子。分别通过IHC和IF对AS模型脊柱组织切片成骨细胞和间充质干细胞进行病理学染色，比较上述注射了Ki8751的干预组和未干预组间关节盘周围两种细胞的数量变化，检验VEGFR2信号轴在小鼠脊柱部位干细胞迁移和成骨分化中的作用。 四、研究结果 第一部分：(1)通过单细胞转录组学测序及分析，结果在AS和对照组(腰椎骨折病人)腰椎韧带附着点共鉴定出26个细胞亚群，并且M2型巨噬细胞亚群和干细胞亚群之间存在强相关联，并在AS中均特征性高分化。生物信息学分析得到，在AS中M2型巨噬细胞(10亚群)可能通过过表达VEGFA进一步促进干细胞亚群(0亚群)的成骨分化。(2)对各样本VEGFA表达量的检测显示，其在AS患者的血清、单核细胞和腰椎韧带组织内均高表达。 第二部分：(1)AS和对照组腰椎韧带巨噬细胞和VEGFA荧光标记，相关性分析结果显示，AS腰椎韧带处巨噬细胞数量和VEGFA表达量较对照组均增加，且二者成正相关。(2)流式鉴定结果显示M2型巨噬细胞和韧带干细胞均符合要求。(3)TNF-α的刺激实验表明，其可以促进AS患者M2型巨噬细胞分泌VEGFA，且分泌量随刺激浓度增加而增加。(4)韧带干细胞成骨诱导实验表明，AS韧带干细胞成骨分化能力较对照组增强。(5)AS患者M2型巨噬细胞培养上清及VEGFA的刺激实验表明，VEGFA能够促进韧带干细胞成骨分化能力和成骨相关基因表达。(6)通过GO分析对AS韧带干细胞中VEGFA受体相关富集基因进行分析发现，PI3K/Akt的激活可能参与AS腰椎韧带干细胞成骨分化。(7)综合VEGFA在AS腰椎韧带干细胞上的配体受体荧光共定位、刺激实验、VEGFA受体磷酸化检测以及信号通路检测，我们发现在AS腰椎韧带干细胞成骨分化进程中，VEGFA能够激活其表面VEGFR2受体磷酸化和PI3K/Akt信号通路。(8)上述通路抑制试验和受体抑制试验表明VEGFA介导的AS腰椎韧带干细胞成骨分化作用能够被抑制剂降低，提示其可能通过此二者介导成骨表型。(9)细胞迁移实验证实VEGFA可以促进AS腰椎韧带干细胞迁移，并且抑制VEGFR2可以阻止其迁移。 第三部分：(1)通过RT-qPCR和WesternBlot检测慢病毒干扰后的U937细胞系VEGFA表达，相比未干扰组U937细胞系中VEGFA表达量显著降低，提示VEGFA稳定干扰的U937细胞系构建成功；共培养实验表明以TNF-α为代表的炎症微环境刺激下，AS巨噬细胞能够以M2的形式分泌VEGFA刺激腰椎韧带干细胞成骨分化。对VEGFA进行干扰后，巨噬细胞的促成骨能力下降。(2)小动物X线、HE染色、番红-固绿染色显示：AS小鼠脊柱椎体间隙变窄、骨赘形成、椎间盘软骨丢失、椎体融合，整体呈现“竹节样改变”，提示模型构建成功。(3)检测显示，VEGFA在AS小鼠脊柱关节盘及其周围组织和血清中高表达。(4)通过设计疾病早、中期两种VEGFR2抑制剂(Ki8751)干预方式对AS模型鼠进行干预。结果表明，相比模型组，干预组能够降低AS小鼠脊柱关节炎性强直评分，且早期干预效果更佳。(5)对比有无抑制剂干预，干细胞荧光双标和成骨细胞免疫组化结果显示，阻断AS小鼠模型VEGFA/VEGFR2信号轴可以抑制其脊柱周围组织干细胞迁移和成骨分化。 五、结论 本课题通过三个部分的实验展示了强直性脊柱炎腰椎韧带附着点部位病理性微环境的细胞构成，并着重探讨了腰椎韧带附着点处巨噬细胞和韧带间充质干细胞的交互关系。揭示了在AS炎症微环境中，巨噬细胞大量表达VEGFA蛋白，通过旁分泌靶向周围韧带间充质干细胞表面VEGFR2受体，并通过激活PI3K/Akt通路介导其迁移和成骨分化的分子机制。VEGFA及其受体有望成为AS病理性异位骨形成的潜在治疗靶标，为临床上抗骨化的靶向药物的开发和使用提供理论依据。
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