摘要
一、研究背景 前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，好发于老年男性，发病率位居男性所有恶性肿瘤的首位。全球范围内，其位于男性癌症发病率第2位，病死率为第5位，在发达国家则分别居男性癌症发病率第1位，病死率的第3位。与国外相比，我国前列腺癌的发病率较低，但明显呈逐年上升的趋势，其已然成为泌尿系统最常见的恶性肿瘤。通常癌症的转移发生在病程的中晚期，但是对于前列腺癌患者，转移的现象往往在早期就已经表现出来，在所有患者中约1/3至2/3初次就诊时已发生淋巴结转移；此外，前列腺癌是最容易发生骨转移的恶性肿瘤，约有40％的患者在初诊时或治疗中会发生骨转移，超过70%的前列腺癌患者会伴发骨转移，死于前列腺癌的患者中85%～100%合并骨转移。但目前为止，对于前列腺癌转移的机制研究和治疗尚未取得突破性进展。因此探索前列腺癌治疗的新靶点，增加对前列腺癌恶性增殖及转移的潜在分子机制的认识，进而为前列腺癌的早期诊断及预后提供科学依据，已成为泌尿外科一项重要的研究课题。 染色体结构维持(SMC)蛋白1A(SMC1A，又名SMC1)基因，是染色体结构维持家族成员(SMC1–6)中具有显著特征性的基因，其作为染色体凝聚复合体(cohesin complex)中重要组成部分之一，主要的生物学功能是参与了姐妹染色单体的集缩过程。凝聚蛋白(Cohesin)复合体是一种人类进化过程中高度保守的蛋白复合体,最早发现于酵母细胞。该蛋白复合体含有4个亚基:即由一对染色体结构维修蛋白SMC1A和SMC3,以及两个非SMC蛋白质RAD21/SCC1和STAG/SCC3/SA构成。现在有研究表明染色体结构的异常改变与肿瘤的发生发展关系密切，并由此推测染色体不稳定性可介导肿瘤的发生。Cohesin蛋白复合体是细胞维持染色体稳定性的关键因子,而SMC1A作为Cohesin的重要亚基之一,其功能异常被发现与包括恶性肿瘤在内的多种疾病相关，目前有个别报道显示SMC1A与恶性胶质瘤、肺癌、肠癌的发生发展相关，但尚无研究表明SMC1A参与调节肿瘤细胞的恶性增殖及迁移、侵袭能力。因此，为了进一步探索SMC1A在前列腺癌恶性增殖及转移中的分子机制，我们利用临床收集的配对前列腺癌与癌旁组织、ONCOMINE基因数据库来检测SMC1A在前列腺癌组织中的蛋白和mRNA表达水平。随后利用慢病毒介导构建敲减SMC1A的前列腺癌细胞模型，进行一系列肿瘤细胞生物学特性及其下游分子机制的探索。 二、目的 检测SMC1A在临床前列腺癌组织中表达水平以及探索SMC1A对前列腺癌细胞的生物学作用及其潜在的分子机制。 三、方法 (一)在前列腺癌临床组织标本及Oncomine基因数据库中检测分析SMC1A的蛋白和mRNA的表达水平及与临床指标的相关性。 于2012年1月至2014年12月在我院泌尿外科收集45对前列腺癌及癌旁配对组织标本。通过石蜡切片免疫组化和新鲜组织WesternBlot检测前列腺癌组织中SMC1A的蛋白表达水平。应用Oncomine癌基因芯片数据库分析SMC1A在前列腺癌中mRNA表达水平，分析其与临床指标之间的相关性。 (二)构建敲减SMC1A-shRNA慢病毒载体和转染筛选SMC1A稳定沉默的前列腺癌细胞株 应用WesternBlot和Real-timePCR方法检测4种前列腺癌细胞株(2种激素敏感性和2种激素抵抗性细胞株)中SMC1A的蛋白以及mRNA表达水平，选择其表达水平相对较高的2株前列腺癌细胞株，利用带有绿色荧光(GFP)sh-SMC1A的慢病毒载体转染，获得SMC1A稳定沉默的前列腺癌细胞株。评估感染效率需要通过观察绿色荧光(GFP)的表达强弱以及范围等指标，沉默后前列腺癌细胞中SMC1A的蛋白和mRNA表达水平分别利用WesternBlot和Real-timePCR来检测，以此评估SMC1A的敲减效率。 (三)探索敲减SMC1A后对前列腺癌细胞生物学功能的影响 在成功构建SMC1A稳定沉默的前列腺癌细胞株基础上，采用MTT实验和细胞集落形成实验检测在前列腺癌细胞株中敲减SMC1A后对前列腺肿瘤细胞恶性增殖的影响；前列腺癌细胞株中敲减SMC1A后对肿瘤细胞周期时相以及凋亡的影响，则通过流式细胞检测技术来验证；同时利用细胞迁移、侵袭实验检测前列腺癌细胞株中敲减SMC1A后对肿瘤细胞恶性转移能力的影响。 (四)探索敲减SMC1A后对前列腺癌细胞在体内成瘤能力的影响 在裸鼠右翼皮下接种SMC1A稳定沉默的前列腺癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验，接种后28天内连续观察肿瘤于裸鼠皮下的生长过程，同时检测肿瘤的体积大小以及瘤体的重量改变。 (五)探索SMC1A稳定沉默后影响前列腺癌恶性增殖及转移的分子机制 采用蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测在前列腺癌细胞株中敲减SMC1A对恶性增殖及转移相关分子的影响，阐释其可能分子机制。 四、结果 (一)在前列腺癌组织中SMC1A的蛋白表达水平上调 通过WesternBlot对前列腺癌组织与配对癌旁前列腺正常组织进行检测，我们发现前列腺癌组织中SMC1A的蛋白表达水平相对于正常前列腺组织上调。石蜡切片免疫组化实验发现前列腺癌组织标本染色阳性细胞数目较正常前列腺组织标本显著增多(P＜0.001)。 (二)利用Oncomine基因芯片数据库分析发现SMC1A表达水平与术后生化复发及恶性转移密切相关。 通过Oncomine基因芯片数据库中Singh(n=102例)和Welsh(n=34例)前列腺癌数据分析，发现SMC1A表达水平在前列腺癌组织较正常前列腺组织显著上调(Singh前列腺癌数据：P＜0.001，Welsh前列腺癌数据：P=0.015)。此外，进一步对Glinsky前列腺癌数据库进行分析，结果提示术后3年生化复发的前列腺癌患者中SMC1A表达水平较未复发患者升高(P=0.0408)。此外，我们还发现SMC1A表达水平与前列腺癌远处转移呈正相关，在转移灶中显著高表达(Holzbeierlein前列腺癌数据：n=79，P=0.0307)，在其他两个前列腺癌数据库中也有同样的发现(LaTulippe前列腺癌数据，P=0.0087；Chandran前列腺癌数据，P=0.0047)，其中SMC1A高表达水平最显著的转移灶，包括淋巴结、肝、骨、肺等。 (三)通过慢病毒介导sh-SMC1A感染前列腺癌细胞株，构建SMC1A稳定沉默的前列腺癌细胞株。 WesternBlot和Real-timePCR检测四种前列腺癌细胞株(PC-3、DU145、LnCap、22RV1)中SMC1A的蛋白和mRNA表达水平，挑选SMC1A表达水平相对较高的PC-3和DU145前列腺癌细胞株，两者属于激素抵抗性前列腺癌(CRPC)细胞株。PC-3和DU145前列腺癌细胞株感染SMC1A敲减的慢病毒，WesternBlot和Real-timePCR明确SMC1A成功敲减，SMC1A稳定沉默的前列腺癌细胞株成功建立。 (四)敲减SMC1A基因后抑制前列腺癌细胞的恶性增殖和转移能力，且诱导细胞周期G0/G1期阻滞。 前列腺癌细胞株PC-3和DU145中敲减SMC1A基因，细胞增殖能力(MTT实验)相对于对照组明显受到抑制(PC-3:P＜0.001;DU145:P＜0.001)。SMC1A沉默的前列腺癌细胞较对照组细胞显著抑制其单细胞集落形成大小和集落数量(PC-3:P=0.0002;DU145:P＜0.0001)。PC-3和DU145细胞敲减SMC1A后，流式细胞检测技术发现SMC1A沉默组细胞周期G0/G1期阻滞(PC-3:P＜0.05;DU145:P＜0.05)，同时S期细胞比例下调(PC-3:P＜0.01;DU145:P＜0.001)，sub-G1期的细胞上调(PC-3:P＜0.05;DU145:P＜0.01)。最后，我们发现敲减SMC1A后显著抑制前列腺癌细胞PC-3和DU145的恶性迁移能力(PC-3:P＜0.01;DU145:P＜0.001)。 (五)敲减SMC1A基因后显著抑制前列腺癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力。 为了进一步研究SMC1A基因在体内水平对肿瘤细胞成瘤能力的影响，敲减SMC1A基因的前列腺癌细胞和对照组细胞接种裸鼠体内进行裸鼠皮下成瘤实验。我们观察到敲减SMC1A显著抑制DU145细胞在裸鼠体内的生长。在裸鼠饲养的第28天，处死裸鼠获取肿瘤组织，SMC1A沉默组肿瘤组织重量与对照组相比显著减少(P＜0.001)。 (六)敲减SMC1A基因后影响Snail/E-cadherin信号通路蛋白的表达。 为了探索SMC1A基因调控前列腺癌细胞恶性增殖和转移的可能分子机制，在SMC1A沉默组和对照组细胞中利用WesternBlot检测增殖和转移的相关的明星通路(Snail/E-cadherin信号通路和MMPs相关蛋白等)的表达水平。我们发现PC-3和DU145细胞敲减SMC1A后下调了snail和slug蛋白表达水平，同时上调了E-cadherin蛋白表达水平。 五、结论 1、在前列腺癌组织中SMC1A的表达显著上调，且其表达水平的高低与前列腺癌恶性转移呈正相关。 2、敲减SMC1A通过下调Snail/E-cadherin信号通路抑制前列腺细胞的恶性增殖和转移能力 3、SMC1A作为癌基因，在促进前列腺癌恶性增殖和转移方面起着重要的作用。
NETL