摘要
菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是十字花科二年生草本植物，始载于《神农本草经》，其干燥根入药即为中药板蓝根，是我国自古以来常用的清热解毒类中草药，也是我国种植面积广、市场需求量大、应用广泛的大宗中药材之一。木脂素类化合物是板蓝根主要抗病毒活性成分，含量低下是限制其深度开发和临床应用的重要原因。挖掘高效调控靶点，开展以提升菘蓝(板蓝根源植物)活性木脂素含量为目标的代谢工程具有重要的现实意义和应用前景。 AP2/ERF转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与植物初生和次生代谢调控，然而对菘蓝中AP2/ERF转录因子家族研究报道较少。本研究对菘蓝AP2/ERF转录因子家族进行基因组数据挖掘分析，共筛选得到126条AP2/ERF基因，分布于五个亚家族，其中AP2亚家族17条、DREB亚家族51条、ERF亚家族51条、RAV亚家族6条和Soloist亚家族1条，其编码的蛋白全长从134aa到578aa，分子量从14.5kDa到63.9kDa，等电点从3.95到10.75；通过序列多重比对证明ERF、DREB两个最大的亚家族基因均含有一个AP2结构域；构建菘蓝AP2/ERF家族基因系统进化树，证实同一亚家族基因进化关系更近；利用保守motif分析，证实菘蓝AP2/ERF家族基因均含有至少一个AP2结构域的保守motif基序，并且不同的亚家族基因有其特异性的保守motif基序；染色体定位分析表明有122条AP2/ERF基因定位到菘蓝7条染色体上。 前期研究发现，受激素诱导的AP2/ERF转录因子LTF1(lignan biosynthesis-associated transcription factor 1)可能参与菘蓝木脂素合成调控，有望成为通过代谢工程手段提高活性木脂素含量的遗传操作靶标，然而其生物学功能尚未被证实。因此，我们提出科学问题：LTF1是否影响菘蓝中活性木脂素的生物合成以及如何发挥调控作用。针对这一科学问题，结合预实验结果，提出研究假说：LTF1可能通过直接结合菘蓝木脂素合成途径中关键基因的启动子，激活其表达，从而影响木脂素的生物合成。 本研究重点对LTF1的基本特征、生物学功能和作用机制进行了解析。克隆了LTF1基因和其启动子，表征其基本特征，LTF1基因全长645bp，翻译后蛋白分子量为24.2kDa，等电点为5.31；LTF1具有一个保守的AP2结构域，属于ERF亚家族基因，其启动子含有激素响应元件等顺式作用元件，进化树分析表明其与十字花科植物同源基因的同源性较高；通过GUS染色实验和亚细胞定位实验分别证明LTF1在根中表达并且是核定位基因，符合LTF1在菘蓝根中行使转录调控功能的研究假说；首次在菘蓝中建立了CRISPR-Cas9介导LTF1基因编辑系统，基于此对LTF1进行突变失活，获得27株LTF1基因编辑毛状根系，基因编辑效率达到69.2%；对基因编辑毛状根进行表型分析及基因表达水平分析，发现木脂素合成途径关键基因(DIR1、DIR2、PAL2、CAD1、PLR2和4CL2)的表达水平较于野生型显著下调，表明敲除LTF1影响了木脂素合成途径基因的表达；松脂醇、落叶松脂素、开环异落叶松脂素等活性木脂素成分含量较于野生型显著降低，其中落叶松脂素含量降低至野生型含量的4.36%，表明LTF1正向调控木脂素生物合成；间苯三酚和番红O-固绿染色实验结果表明LTF1基因编辑毛状根中木质素合成受阻，提示LTF1可能影响木质素和木脂素的积累，进而影响菘蓝的逆境胁迫响应过程。为研究LTF1的调控机制，筛选了10条木脂素生物合成途径关键基因，其启动子序列均含有AP2/ERF转录因子特异性结合位点GCC-box，涵盖菘蓝木脂素生物合成途径上下游的8步反应，通过酵母单杂交和凝胶迁移(EMSA)实验分别验证了LTF1在体内外直接结合木脂素合成途径基因(DIR1、PAL2、PAL4、C3H、PLR2、4CL2、CAD1、CAD2、CCR2)启动子的GCC-box元件，进而通过激活上述途径基因的表达，对菘蓝木脂素生物合成途径进行全局调控，而对于CCoAOMT3基因则不能直接结合。为了拓展对LTF1调控网络的解析，研究了已报道的菘蓝木脂素合成正调控因子WRKY34与LTF1的互作关系，酵母双杂交实验暗示二者存在体内互作，可能发挥协同调控作用，为进一步研究LTF1对木脂素合成的调控机制提供了有益启示。 综上，本研究对菘蓝AP2/ERF转录因子家族进行基因组数据挖掘分析，解读了其基因结构和进化特征，为后续研究该家族基因的生物学功能和潜在应用价值提供参考。针对前期筛选得到的潜在调控靶点LTF1，明确了其对菘蓝木脂素生物合成的正调控作用；首次建立了菘蓝CRISPR-Cas9介导基因编辑体系，为其在菘蓝基因工程育种的应用打下了基础，同时也该技术体系在其它药用植物的应用提供了借鉴。解析了LTF1调控菘蓝活性木脂素生物合成的作用机制，为后续开展以LTF1为操作靶点的精准代谢工程，改良菘蓝种质资源提供了理论依据。
NETL