摘要
研究背景与目的： 脓毒症(sepsis)指机体对于感染的失控反应所导致可以威胁生命的器官功能障碍，以感染、炎症反应、器官功能受损为特征，是目前全球范围内急危重症领域所面临的最棘手难题，全球死亡率高达25%-30%。抗生素治疗被广泛认为是脓毒症治疗的重要组成部分，流行病学调查显示重症监护病房(ICU)中有64%-71%的患者接受抗生素治疗，其中10%-51%患有医院获得性感染(HAIs)。然而，临床研究表明抗生素并不能完全控制炎症的发展和器官损伤的进一步恶化，甚至会诱导肠道耐药菌的生长，对宿主产生长期的有害影响。CRISPLD2作为血清中天然的LPS结合蛋白，在肠道和血液免疫细胞中表达丰度高，能够竞争性抑制LPS与循环免疫细胞TLR4结合，从而拮抗LPS诱导的瀑布炎症反应。本章拟探讨肠道菌群对CRISPLD2蛋白的调控作用以及在长期广谱抗生素暴露下CRISPLD2对LPS诱导的脓毒症小鼠的炎症反应及生存率的影响。 研究方法：1．小鼠随机分组饲养于不同的笼位，分为对照组和抗生素暴露组(青霉素、万古霉素、亚胺培南、甲硝唑各lOOmg/kg/d)饲养2周。对小鼠小肠内容物标本进行取样，进行微生物16sDNA基因测序，通过聚类分析、差异性分析等生物信息分析手段，对不同样本的微生物进行分类、定量，揭示广谱抗生素对肠道菌群的影响。2．连续14天给予小鼠上述混合抗生素暴露，使用westernblot技术检测小鼠小肠CRISPLD2的表达水平，使用ELISA技术检测小鼠血清内CRISPLD2含量。检测无菌小鼠血清中CRISPLD2的浓度，并与常规饲养组小鼠比较。此外，取常规饲养条件下的小鼠小肠，按照头尾轴方向将小肠共截成8段，利用RT-PCR技术检测小肠不同节断CRISPLD2的转录情况。3．将小鼠分为4组，对照组、LPS诱导的脓毒症组、抗生素暴露下LPS诱导的脓毒症组、经CRISPLD2蛋白治疗的抗生素暴露下LPS诱导的脓毒症组。于24h后检测血清炎症因子的水平，并记录各组脓毒症小鼠的生存曲线。 研究结果： 1．长期广谱抗生素的暴露对小鼠小肠菌群的影响 所有小肠内容物样本中共检测出670551条优化序列，407个OTU，其中核心OTU为7个。小肠内微生物Alpha多样性降低，肠道内物种多样性明显减少，并反映在可代表群落的多样性的shannon指数以及simpson指数上。两组小鼠小肠内容物在不用水平上的的结构及相对丰度发生改变：在门水平上，对照组主要由拟杆菌门(Bacteroidetes，占65.74%)，厚壁菌门(Firmicutes，占23.75%)组成，其次是变形菌门(Proteobacteria，占9.44%)等。抗生素暴露组则主要以变形菌门(Proteobacteria)为主，占93.91%。在属分类水平上，对照组未分类种属占比较大，其次为Turicibacter菌属(13.6%)、类结核菌属(Parasutterella，占9.18%)、Faecalibaculum菌属(4.52%)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus，占1.94%)。抗生素暴露组则以肠杆菌属(Enterobacter)为主，占88.25%，其次为红球菌属(Rhodococcus，占2.91%)、迪茨氏菌属(Dietzia，占1.11%)等。 2．肠道菌群对小鼠CRISPLD2的调控作用 上述广谱抗生素长期暴露后，我们发现肠道中CRISPLD2的表达显著上调，但血清中CRISPLD2的浓度下降。同时，与常规饲养小鼠相比，无菌小鼠中血清CRISPLD2的浓度显著降低。我们还对常规饲养条件下小鼠小肠组织中CRISPLD2的表达进行了自身对比，发现小肠远端区域(回肠)的CRISPLD2表达量显著高于近端区域(十二指肠)。 3．在长期广谱抗生素的暴露下，CRISPLD2对LPS诱导的炎症反应的影响及治疗脓毒症小鼠的效果 静脉补充CRISPLD2蛋白可以下调长期暴露于抗生素的脓毒症小鼠血清中的炎症因子(TNF-a、IL-6)，但各组小鼠的预后无明显差异。LPS诱导的脓毒症小鼠9d的生存率为40%，抗生素暴露下LPS诱导的脓毒症小鼠的9d生存率为40%，经CRISPLD2蛋白治疗的抗生素暴露下LPS诱导的脓毒症小鼠9d的生存率为50%，三组生存曲线无统计学差异。 研究结论： 1．长期广谱抗生素的暴露使肠道菌群结构发生巨大改变，并使菌群多样性显著降低。 2．小鼠小肠组织及血清中CRISPLD2的表达与释放受肠道菌群的调控。 3．在长期暴露于广谱抗生素的LPS诱导的脓毒症小鼠中，重组CRISPLD2蛋白的补充治疗可以减轻小鼠体内的炎症反应，但该蛋白的补充治疗不能转化为长期暴露于抗生素的脓毒症小鼠的生存益处。
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