摘要
旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinella spiralis)引起的一种全球范围流行的食源性人兽共患寄生虫病，不仅对畜牧业造成影响也对人体及动物健康造成危害，严重时可致死亡。通常宿主由于食入含有旋毛虫肌幼虫包囊的肉而感染，感染的旋毛虫对机体多处器官造成严重损伤，引发多种并发症。常应用冷冻方法对肉品进行无害化处理，以期杀灭寄生于肉品中的旋毛虫，但由于旋毛虫其生物学特性具有耐低温的能力，对肉品的无害化处理造成一定影响。本实验对冷应激下旋毛虫肌幼虫热休克蛋白70(TsHSP70)变化进行研究，以探究TsHSP70对旋毛虫冷应激的保护机制。 本实验首先在冷、热应激与盐度胁迫下，应用实时荧光定量PCR方法(qPCR)对旋毛虫肌幼虫烯醇化酶(TsENO1)、冷休克DNA结合结构域蛋白(TsCDSPs)、热休克蛋白70(TsHSP70)和热休克蛋白90(TsHSP90)基因的转录水平进行检测，由检测结果可知，冷应激后TsHSP70和TsCDSPsmRNA转录水平提升且在-4℃培养2h时达峰值，而TsENO1和TsHSP90变化不明显且无明显规律性;热应激后TsHSP70和TsHSP90mRNA转录水平均提升，而TsENO1和TsCDSPs无变化;盐度胁迫后TsCSDPsmRNA转录水平提升且在20‰盐度培养3h时上升最显著，TsHSP90mRNA转录水平升高且在30‰盐度培养3h时达峰值，而TsENO1和TsHSP70无变化。推测TsHSP70和TsCDSPs在冷应激过程中、TsHSP70和TsHSP90在热应激过程中以及TsCSDPs和TsHSP90在盐度胁迫过程中对旋毛虫肌幼虫起保护作用。冷、热应激下旋毛虫肌幼虫活力及其存活率检测结果显示，相同培养时间条件下，旋毛虫肌幼虫活力及其存活率随温度降低而下降;在相同温度条件下，随着培养时间的增加，各组旋毛虫肌幼虫活力及其存活率降低，且在-10℃培养4h时存活率仅为20％，说明持续性的冷、热应激不利于旋毛虫肌幼虫的体外生存。盐度胁迫下旋毛虫肌幼虫活力及其存活率检测结果表明，短时间内15～30‰的盐度条件对旋毛虫肌幼虫的体外生存无明显影响。根据上述实验结果，由于TsHSP70mRNA转录水平随冷应激变化十分显著，后续着重针对冷应激与TsHSP70基因进行实验研究。 根据NCBI已发表的旋毛虫热休克蛋白70基因设计引物并添加酶切位点，应用分子生物学技术从旋毛虫肌幼虫中克隆出TsHSP70，将克隆后基因片段与pMD-18T载体连接后转入感受态细胞DH5α，经测序结果比对与原序列同源性达到99.23％。将克隆质粒与表达载体pET-32a(+)双酶切后进行连接，并转入感受态细胞BL21中，将菌液测序结果正确的菌株扩大培养并诱导表达。对重组蛋白诱导剂IPTG的诱导时间和诱导浓度进行优化，在37℃时1.0mMIPTG诱导6h时表达量最大，其重组蛋白以包涵体形式表达。将表达所得TsHSP70重组蛋白纯化后注射家兔，制备TsHSP70多克隆抗体血清。应用ELISA、Westernblot对制备的多克隆抗体进行抗原性检测，应用激光共聚焦显微镜进行免疫荧光检测，结果显示抗体效价达到1∶51200;制备的多克隆抗体与纯化后的TsHSP70蛋白及旋毛虫肌幼虫中的HSP70蛋白均具有良好的反应性，且具有特异性;荧光定位显示TsHSP70蛋白主要分布于旋毛虫肌幼虫表皮组织，且在头端较为丰富。 为进一步验证冷应激与TsHSP70表达量间相关性，应用qPCR方法和Westernblot方法对TsHSP70进行检测，在相同培养时间、不同培养温度培养旋毛虫肌幼虫时，-4℃培养组的肌幼虫基因转录水平和蛋白翻译水平较对照组分别提升117.13％和61.83％，表达量显著上升;在-4℃培养肌幼虫不同时间，检测基因转录水平和蛋白翻译水平TsHSP70的变化，2h培养组的肌幼虫较对照组分别提升130.86％和158.64％，变化最显著。由此更进一步证明，冷应激下TsHSP70基因转录水平与蛋白含量均上升，TsHSP70极可能参与冷应激下旋毛虫肌幼虫的保护过程。 利用热休克蛋白抑制剂和诱导剂与旋毛虫肌幼虫共培养后，检测TsHSP70基因转录水平的变化，并对抑制剂和诱导剂的作用浓度与时间进行条件优化，应用优化条件后的抑制剂和诱导剂处理虫体，在基因转录水平与蛋白翻译水平分析抑制剂和诱导剂对TsHSP70表达的影响，研究结果显示，置于30μg/mL浓度槲皮素溶液37℃培养6h的肌幼虫较对照组降低32.99％和55.38％;置于20μM浓度PES37℃培养48h的肌幼虫较对照组降低58.45％和76.84％;置于8mM谷氨酰胺溶液培养24h的肌幼虫较对照组升高41.68％和19.78％。上述实验结果表明，抑制剂槲皮素与PES可降低TsHSP70表达，诱导剂谷氨酰胺可使TsHSP70表达提升，选用PES与谷氨酰胺的最佳作用条件进行后续旋毛虫肌幼虫冷应激下抗氧化能力的研究。 将旋毛虫肌幼虫分别置于PBS溶液、20μM浓度PES培养48h及8mM谷氨酰胺溶液培养24h，经-4℃冷应激0、2、4、6、8、10h后收集虫体制备成匀浆组织，利用试剂盒测定SOD活性、MDA含量和GSH含量，研究TsHSP70对旋毛虫肌幼虫的抗氧化能力的调节。实验结果显示，旋毛虫肌幼虫SOD活性随冷应激时间延长呈先升后降趋势，Gln培养组较对照组SOD活性明显提升，而PES培养组SOD活性随时间增长整体呈先降后升趋势;随冷应激时间增长旋毛虫MDA含量总体呈上升趋势，经抑制剂和诱导剂处理后的肌幼虫在冷应激下MDA含量略有变化但不明显;GSH含量随冷应激时间延长整体呈先升后降趋势，Gln培养组较对照组GSH含量升高，PES培养组GSH含量相对平稳。根据上述实验结果推断，较弱冷应激会提升旋毛虫肌幼虫抗氧化能力，但冷应激强度超出虫体抗氧化调节能力范围时，虫体将遭受一定程度的氧化损伤，而TsHSP70在旋毛虫肌幼虫受氧化损伤时可起到保护作用，使旋毛虫抗氧化能力增强。 综上所述，本研究证实，冷应激使旋毛虫TsHSP70显著提升，TsHSP70可通过提升旋毛虫肌幼虫抗氧化能力，起到冷应激下对虫体的保护作用，为深入研究旋毛虫应激过程中TsHSP70的保护机制奠定基础，为旋毛虫病预防与治疗提供新的研究思路。
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