摘要
苜蓿(Medicago)是一种种植区域遍及世界各地的豆科牧草，因为它适应性广和产量高，并且含有丰富的蛋白质、矿物质和维生素等多种营养物质，因此它有“牧草之王”的称号。近几年来，苜蓿病毒病在新疆北区传播较严重，发病率能达到20％-100％，影响了苜蓿的产量及品质。其中苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)是影响苜蓿产量和品质的主要病毒病害，发病率最高能达到91％，它寄主范围广，常见的包括大豆、马铃薯、苜蓿、豇豆、菜豆等重要的经济作物及豆科牧草。本研究是对采自黑龙江大学实验田感病的大豆样本通过小RNA测序、RT-PCR检测和全基因组的克隆等技术进行分离鉴定，并使用了侵染性克隆技术对其进行研究，获得的主要实验结果如下: (1)利用小RNA深度测序结合组装技术对采自黑龙江省哈尔滨市大学试验田疑似感病大豆的样品进行了鉴定与分析，小RNA测序后在NCBI核苷酸和氨基酸数据库检索，检索后发现有41个contigs与AMV的基因组序列有高度的同源性。通过RT-PCR对大豆样品进行检测，PCR扩增出长度为666bp的AMVCP基因条带，确定了AMV可以侵染大豆。之后通过分段克隆PCR扩增AMV的全基因组，测序后使用软件拼接序列得到AMV的全基因组长度为AMVRNA1(3643nt)、RNA2(2594nt)和RNA3(2008nt)。将AMV-Soybean与NCBI上其他来源的AMV分离物进行核苷酸和氨基酸序列相似性分析。结果显示AMV-SoybeanRNA1和RNA2与加拿大的Ca175-1(MK607974)同源性最高，同源性为98.40％。AMV-SoybeanRNA3与阿根廷的Manfredi(KC881010)同源性最高，同源性为98.21％。核苷酸系统发育进化树分析显示AMV-SoybeanRNA1、RNA2和RNA3与加拿大的175(MF990284)、Ca175-1(MK607974)、中国杭州的HZ(HQ316636)和中国的Gyn(MH332899)亲缘关系较近。初步确认了从大豆上分离出了AMV，命名为AMV-Soybean(GenBank登录号:MT362607-MT362609)，并将AMV-Soybean的全基因组序列信息发布在NCBI上，这是我国黑龙江省对在大豆上发现AMV的首次报道。 (2)利用酵母转化伴随的同源重组构建了一种AMV侵染性克隆及重组农杆菌，本实验构建的AMV侵染性克隆不仅利用了酵母菌自身存在的重组机制，避免了使用体外DNA连接繁琐过程和可能对大肠杆菌产生毒性不稳定等问题，提高了AMV的侵染效率。结果发现AMV侵染性克隆能够侵染本氏烟植株。将侵染性克隆接种后发病的烟草叶片摩擦接种回接到健康的烟草、黄坡扇子白、黑农52号和金元一号大豆上发现能致其发病，证明本研究构建的AMV侵染性克隆具有较强的致病性。 (3)本研究选取了22种东北地区典型的大豆品种，这22种大豆品种依次是垦农28号、东农253号、蒙豆28号、东农50号、合丰25号、华疆一号、黑农52号、圣豆58号、黑豆、黄坡扇子白、东农48号、八月炸、黑河43号、晚黄大豆、五月炸、金元一号、绥农14号、小粒豆、白毛豆、绥农11号、北豆40号、吴疆一号。每个品种种植5株。将采集的AMV大豆感病样品摩擦接种这22种大豆，筛选AMV抗病品种。接种14天后观察大豆叶片发现五月炸和白毛豆无明显的症状，而其他大豆品种则出现黄化、斑驳和叶畸形等症状。通过提取70个大豆样品系统叶的总RNA，使用特异性引物对其进行RT-PCR检测，结果显示均能够从这22种大豆的未接种叶片中检测到AMVCP基因，此结果证明五月炸和白毛豆为耐病品种，而其他20个大豆品种对AMV敏感，为感病大豆品种。
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