摘要
水稻立枯病是旱育秧田的重要病害之一，对水稻生产构成严重威胁，目前常见的化学防治方法造成的环境安全问题令人堪忧。此外，病原菌对化学杀菌剂的抗性问题日益突出，生产上迫切需要环境友好的新型药剂解决这一问题。本研究从水稻中分离、鉴定出能有效防治立枯病的内生菌，采用单因素和正交试验法对内生菌的发酵培养基及条件进行优化，并对水稻秧苗立枯病防治效果进行验证，采用代谢组学方法鉴定其潜在的抗菌代谢产物，研究结果如下: (1)在水稻立枯病发病中心周围选取健康水稻秧苗，从其根、茎、叶组织共分离出93个菌株，采用滤纸片法筛选到15株内生菌对尖孢镰刀菌具有拮抗活性。其中，内生菌mdj-15的抑菌率为55.95±1.72％，显著高于其他菌株，作为优势菌株进行后续研究。经过形态观察和生理生化测定及16SRNA基因序列分析鉴定内生菌mdj-15为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 (2)培养基中各成分对发酵液的抑菌活性的影响大小依次为A(可溶性淀粉)＞C(NaCl)＞E(KCl)＞D(KH2PO4)＞B(酵母膏)。内生菌mdj-15的最优发酵培养基配方为:可溶性淀粉20g/L，酵母膏2g/L，NaCl10g/L，KH2PO41g/L，KCl1g/L，MgSO40.5g/L，MnSO45.0mg/L,CuSO40.16mg/L,FeSO40.15mg/L。 发酵条件对发酵液的抑菌活性的影响大小依次为B(时间)＞A(接种量)＞D(pH值)＞C(温度)＞E(转数)，内生菌mdj-15最优发酵条件为:接种量为5％，发酵时间为20h，温度为30℃，pH为6，转数为180rpm。 优化后的发酵液对尖孢镰刀菌的抑菌率为67.77％，比优化前发酵液抑菌率提高20.59％。 (3)内生菌mdj-15发酵液对水稻立枯病具有显著防效，在接种立枯病原菌后温度为15℃、20℃和25℃条件下，防效分别为:69.23±2.09％、74.57±0.43％和73.57±6.11％，显著高于化学药剂噁霉灵和甲基硫菌灵，在30℃条件下，内生菌mdj-15的防效与化学药剂相比差异不显著。 (4)在15℃、20℃、25℃和30℃条件下，内生菌mdj-15发酵液可诱导水稻叶片SOD活性升高，除15℃、20℃时与噁霉灵处理差异不显著，其余条件下均显著高于噁霉灵处理、甲基硫菌灵处理和清水处理。不同温度条件下，随着温度的降低，SOD酶活性整体呈现先升高后降低的趋势，20℃条件下，内生菌mdj-15处理的SOD活性达到最大值，比清水处理SOD活性提高75％。 在15℃、20℃、25℃和30℃条件下，内生菌mdj-15发酵液处理的水稻叶片的POD活性与噁霉灵、甲基硫菌灵和清水处理相比，除20℃时与噁霉灵处理差异不显著外，其余均显著性升高。随着温度的降低，POD活性呈现先升高后降低的趋势，20℃时POD活性最高。在15℃、20℃、25℃和30℃条件下，内生菌mdj-15处理的POD酶活性比清水处理分别提高了51％、51％、54％和25％。 在15℃、20℃、25℃和30℃条件下，内生菌mdj-15发酵液处理的水稻叶片CAT活性与对照噁霉灵处理差异不显著，但显著高于甲基硫菌灵处理和清水处理。与SOD和POD的变化趋势相似，随着温度的降低，各处理CAT酶活性均先升高后降低。在15℃、20℃、25℃和30℃条件下，内生菌mdj-15处理的POD酶活性比清水处理分别提高了71％、70％、62％和49％。 (5)内生菌mdj-15发酵液处理的种子发芽势分别高出清水及液体培养基处理10.53％、12.00％，并呈显著性差异，内生菌mdj-15发酵液处理后的种子发芽率分别比清水、液体培养基处理高出4.83％、3.58％。结果表明mdj-15发酵液对水稻种子发芽有促进作用;mdj-15发酵液处理后水稻幼苗株高为18.44±0.14cm，根长为6.61±0.04cm，根数为13.43±0.17，鲜重28.36±0.15g，干重为5.11±0.02g，与清水和内生菌培养基处理相比均有显著的促进作用。 (6)利用代谢组学的研究方法，对内生菌mdj-15发酵液中所有代谢物质进行检测，菌株mdj-15和对照菌株mdj-34发酵液中代谢物存在显著差异，两组样品有很好的区分，各自聚类明显。在mdj-15和mdj-34两组样本中，正离子模式下筛选出差异显著的代谢物有166种，负离子模式下筛选出差异显著的代谢物有57种。其中，差异最显著的代谢物质主要包括氨基酸、有机酸、酮类、醇类、含氮化合物等。 通过KEGGPathway富集分析，对差异代谢产物进一步的研究，确定了差异代谢物参与的最主要生化代谢途径包括次生胆汁酸的生物合成、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸生物合成、苯甲酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、鞘脂类代谢、二甲苯降解、乙醛酸和二羧酸代谢、硫代谢、碳代谢、细菌趋化性、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、丙氨酸代谢、抗菌素的生物合成、万古霉素耐药性和芳香化合物的降解。在这些途径中，次生胆汁酸生物合成和甘油磷脂代谢是富集最显著的途径。
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