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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向小麦MIR408基因

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小麦(Triticum aestivum L.)是重要的粮食作物之一。目前，国内种植的小麦可分为春小麦和冬小麦两类，由于大部分冬小麦品种难以在东北气候条件下越冬，因此，限制了其在黑龙江的推广种植。东农冬麦1号(Dn1)是我国首例能在高寒地区越冬的冬小麦品种(返青率大于85％)，是作物抗寒研究的珍贵材料。MicroRNA(miRNA)是长度为20-24个核苷酸的小内源性非编码RNA，在植物响应非生物胁迫中具有重要作用。miRNA由MIR基因编码，能够通过与其靶基因作用，从分子层面调控植物的信号网络，从而对外界胁迫作出应答以减轻伤害。因此，miRNA作为作物基因改良的靶向目标受到了越来越多的关注。miR408是一种广泛分布于植物中，具有较高保守性的miRNA。实验室前期研究表明，miR408参与了Dn1对低温胁迫的响应及调控。基因突变是研究植物基因功能和作物基因改良的重要方法之一，而基因编辑技术能够在植物基因组特定位点产生突变从而加快相关研究的进程。与ZFN和TALEN等基因编辑技术相比，近几年出现的CRISPR/Cas9技术具有效率高、操作相对简单等优势，因此，CRISPR/Cas9技术得到了广泛的应用。本研究通过农杆菌转化小麦成熟胚愈伤组织，利用CRISPR/Cas9技术靶向Dn1的MIR408基因，探究了CRISPR/Cas9技术应用于靶向小麦非编码基因的可能性，为利用基因敲除的方法进行小麦miRNA功能研究奠定了基础。本研究的具体结果如下: (1)根据GenBank中提供的TaMIR408-A、B、D及miR408序列信息，确定了TaMIR408的基因组位置以及保守性情况。pre-miR408二级结构预测结果表明miRNA:miRNA*区域结构不明显，因此，选择靶向TaMIR408的成熟miRNA保守区域，设计了同时靶向TaMIR408-A、B、D基因的3个sgRNA:miR408-sgRNA1、2、3，生物信息学分析结果表明，3个sgRNA的GC含量均为65％，且具有stemloopRAR、2、3二级结构。 (2)构建了两种带有单sgRNA的CRISPR/Cas9载体—pTKC1.2和pBUE411-TaU3p。pTKC1.2的构建方法为首先通过overlapPCR合成由TaU6启动子启动的sgRNA表达框，然后通过onestepclone方法将sgRNA1、2、3表达框与PmeⅠ酶切后的pTKC1.2载体连接;pBUE411-TaU3p的构建方法为先将sgRNA1单链DNA引物退火合成带有粘性末端的sgRNA引导序列，然后通过T4连接酶与BsaⅠ酶切后pBUE411-TaU3p载体连接。 (3)分别设计了能够克隆含有TaMIR408-A、B、D的DNA片段的特异性PCR引物，通过PCR检测选择合适的克隆引物，将目的片段连接到克隆载体上进行测序，结果表明，Dn1的MIR408序列与中国春数据库的序列相同。 (4)将T7启动子与编码sgRNA的DNA序列连接并在体外转录，获得sgRNA;spCas9/sgRNA体外酶切反应结果表明，miR40g-sgRNA1、2、3能够在体外靶向切割TaMIR408基因，且3个sgRNA的活性相似。 (5)利用Dn1的成熟胚进行愈伤组织诱导，利用含pTKC1.2-sgRNA1、2、3的农杆菌转化3-4周的新鲜愈伤组织，共培养5d，恢复培养14d，而后诱导再生植株。通过对Cas9表达框进行检测，共鉴定出3株miR408-sgRNA1的T0转基因植株，表明利用农杆菌介导的转化方法能够将CRISPR/Cas9系统导入到小麦中。由于小麦的转化过程通常会产生嵌合体植株，因此在T0代未检测到发生基因编辑，目前已将再生植株移植到大田中以期获得T1代植株，从而进行进一步的检测。

任治鹏

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小麦 miR408基因 CRISPR/Cas9技术 成熟胚

硕士

生物学；植物学

苍晶

2021

东北农业大学

中文

S5