摘要
1、研究背景 肺动脉高压(PAH)是一种慢性肺血管疾病，预后差，死亡率高。肺动脉高压的特点是血管阻力不断提高，导致右心室肥大甚至右心衰竭。肺动脉平滑肌细胞过度增殖和肺动脉内皮细胞功能障碍导致肺动脉重构，远端肺血管结构重构是肺动脉高压的关键事件，血管肌肉化被认为是主要的病理基础。目前，肺动脉高压的确切的发病机制尚未完全明确，迄今为止仍没有有效的治疗方案。目前对于肺动脉高压治疗主要是单独或联合使用肺动脉高压靶向治疗药物，这些治疗能够改善功能和血流动力学，并减少住院率，但并不针对肺动脉高压发病机制的关键特征，也并没有降低死亡率，五年后死亡率仍保持在50％左右。 外泌体由功能蛋白、信使核糖核酸和微核糖核酸组成的直径范围为50-150纳米的小泡。外泌体可由多种细胞分泌，其蛋白质含量取决于分泌它们的细胞类型。外泌体含有多种生物标记，在多种生物过程(如血管生成、抗原呈递、凋亡、凝血、细胞内环境稳定、炎症和细胞间信号传导)中发挥重要作用，这些作用主要归因于它们转移核糖核酸、蛋白质、酶和脂质的能力，进而影响各种疾病(包括癌症、神经退行性疾病、感染和自身免疫性疾病)的生理和病理过程。 2、研究目的 鉴于复杂的途径参与了肺动脉高压的发病机制，针对不止一个途径和可能不止一个细胞靶点的外泌体治疗可能更有效。本实验应用野百合碱(MCT)建立大鼠肺动脉高压模型及体外低氧建立肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞模型，观察MSC-EXOs对PAH治疗作用，并探讨其作用机制，为临床进一步治疗PAH提供理论依据 3、研究方法 1.人脐带间充质干细胞的培养及鉴定:通过组织块贴壁法分离人脐带间充质干细胞，镜下观察形态，采用流式细胞仪对其表面抗原标志物(CD29、CD31、CD44H、CD45)进行鉴定，对间充质干细胞进行成骨、成脂、成软骨诱导分化培养鉴定其分化能力。 2.间充质干细胞源外泌体的收集和鉴定:收集第3代至第5代培养MSCs的细胞上清液，差速离心后用大约200ul容积的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电镜观察法观察外泌体大小及形态;免疫印迹分析法鉴定其表面标志物;PKH26染色，与肺动脉内皮细胞共培养24h和48h，在共聚焦荧光显微镜下观察肺动脉内皮细胞对MSC-EXO的摄取情况;最后用BCA蛋白定量试剂盒测量浓度后分装储存于-80℃冰箱中待用。 3.体内实验:取清洁级SD大鼠30只，随机分为间充质干细胞源外泌体治疗组(MSC-EXO组)，肺动脉高压模型组(MCT组)和生理盐水阴性对照组(对照组)。相同条件下饲养动物。MSC-EXO组与MCT组一次性腹腔注射MCT50mg/kg体重，建立肺动脉高压模型。对照组皮下注射等量0.9％生理盐水代替MCT。同等条件下饲养动物。第三周开始EXO组每只大鼠注射25ug-MSC-EXO，MCT组及对照组注射等量的生理盐水，连续注射3天。相同条件下饲养动物。四周后，用戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉大鼠后，用3-FrMiller导管经右颈静脉将大鼠插入右心室，以获得心率(HR)、心输出量(CO)和右心室收缩压(RVSP)的测量值。然后对大鼠实施安乐死并采集心脏，将右心室与左心室和室间隔壁分开，计算右心室(RV)与左心室(L，V)加上隔膜(LV+S)与右心室重量的重量比，量化右心室肥大。右室切片Masson染色观察右室纤维化程度;HE染色观察对肺血管壁增厚的抑制作用;Masson染色与CD31染色观察肺脏纤维化程度与新生血管密度;Westernblot及免疫荧光检测外泌体对血管内皮细胞间质化Marker(CD31、α-SMA以及VE-cad)的表达;Westernblot检测EXO对肺组织蛋白中Wnt/BMPR信号通路中蛋白表达的影响。 4.体外试验: (1)肺动脉平滑肌细胞(PASMCS)的培养及鉴定:在添加平滑肌生长补充剂、100Ug/mL青霉素、100IU/mL链霉素以及10％FBS的平滑肌生长培养基中培养肺动脉平滑肌细胞，每2-3天更换一次培养基，融合细胞＞80％时用0.05％胰蛋白酶消化。检测平滑肌细胞标记物α-SMA以鉴定细胞。 (2)建立低氧肺动脉平滑肌细胞及肺动脉内皮细胞模型:肺动脉平滑肌细胞及肺动脉内皮细胞在无血清培养基中孵育24h，分为正常组(21％O2，5％CO2，74％N2条件下培养)，低氧模型(3％O2，5％CO2，92％N2条件下培养)，添加外泌体组(3％O2，5％CO2，92％N2条件下培养，添加100μg/mL的MSC-EXO)各组在37℃条件下分别培养24h、48h和72h，收集细胞进行实验。免疫荧光检测培养72h后模型中Wnt5a表达。 (3)通过转染Wnt5asiRNA基因使Wnt5a基因沉默，检测mRNA水平及蛋白水平的抑制效率。 (4)肺动脉内皮细胞缺氧暴露48h和72h后，流式细胞仪AV-PI染色检测凋亡;Westernblot及PT-PCR检测抗凋亡基因Bcl2、促凋亡基因caspase-3和Bax的蛋白和mRNA表达情况。 (5)检测MSC-EXO对缺氧诱导的细胞增殖的影响:BrdU法测定PASMC及PAEC的增殖，Westernblot检测PAEC增殖细胞核抗原PCNA蛋白表达。 (6)PAEC小管形成实验及Transwell实验检测MSC-EXO对低氧处理PAEC细胞血管形成，迁移能力的影响。 (7)MSC-EXO对低氧PAEC细胞间质化的影响:免疫荧光和Westernblot检测CD31和VE-cad以及α-SMA蛋白水平。 (8)Westernblot检测检测BMPR信号通路相关蛋白表达。 4、研究结果 1.通过组织块贴壁法分离MSCs接种至培养瓶后，24h后可见细胞贴壁生长，形态为长条形。7天后可见有细胞约90％呈融合状态，形态呈长梭形。流式细胞仪分析结果显示所培养原代细胞表达CD-90(94.9％)，CD-73(91.5％)和CD-105(87.5％)，不表达CD-34(0.7％)，CD-45(0.4％)和HLA-DR。体外成骨诱导培养3周后，茜素红染色观察可见圆形钙结节形成;体外成脂诱导培养2周后，油红O染色可见染成红色的脂滴形成;体外成软骨诱导培养3周后，甲苯胺蓝染色可见呈蓝紫色的软骨细胞。 2.镜下观察可见外泌体为大小不一的颗粒，呈碟状圆形，直径约50-150nm;WesternBlot显示HUMSCs外泌体表达CD63、CD81、TSG101和ALIX;MSC-EXO与肺动脉内皮细胞共培养后24h和48h，在共聚焦荧光显微镜下观察到肺动脉内皮细胞对MSC-EXO的摄取。 3.动物一般情况及存活率:皮下注射野百合碱1周后，实验组(包括MCT组及MSC-EXO组)大鼠出现进食及活动减少，反应迟钝，毛发晦涩无光泽，呼吸急促等症状;对照组大鼠上述特征不明显。MSC-EXO注射3周时EXO组大鼠上述特征好转;而MCT组大鼠上述症状进一步加重。MCT组有3只大鼠，EXO组有2只大鼠死亡。在MCT组和EXO组大鼠的HR和CO没有显著差异;然而，EXO组大鼠的RVSP和右心室/(左心室+右心室)显著低于MCT组大鼠(P＜0.05)。Masson染色示EXO组的右室纤维化程度较MCT组显著降低(P＜0.05)。肺组织HE染色可见:MCT组与对照组比较，肺小动脉管壁明显增厚，管腔狭窄，MCT组的计算血管壁厚度的百分比(WT％)，血管壁面积的百分比(WA％)显著高于对照组，而EXO组显著低于MCT组(P＜0.05)。Masson三色染色显示MCT组大鼠肺间质有明显的胶原沉积，而MSC-EXO处理组大鼠的胶原沉积明显减轻(P＜0.05)。免疫组化显示，与对照相比，MCT组大鼠肺组织CD31蛋白表达明显降低，与MCT组相比，EXO组CD31蛋白表达明显增加。采用免疫荧光和蛋白质印迹法检测肺组织中内皮细胞间质化标记物结果显示，与对照组相比，MCT组α-SMA的表达明显增加，CD31和VE-cadherin的蛋白表达明显降低;与MCT组相比，EXO组CD31和VE-cad-herin蛋白表达明显增加，而α-SMA水平明显降低(P＜0.05)。对骨形态发生蛋白信号轴分子的表达进行了测定，结果表明与对照组相比，MCT组中TGF-β1和Smad2/3的表达显著增高，而BMPR2与Smad1/5/8的表达显著降低(P＜0.05);但在EXO组中TGF-β1和Smad2/3的表达低于MCT组，而BMPR2与Smad1/5/8的表达高于MCT组(P＜0.05)。通过蛋白质印迹检测Wnt5a、β-catenin和cyclinD1的蛋白表达水平。我们发现MCT组wnt5a蛋白水平显著降低，但β-catenin和cyclinD1水平高于对照组，与MCT相比，EXO组Wnt5a表达较高，β-catenin和cyclinD1表达较低(P＜0.05)。 4、(1)镜下观察，细胞呈长梭形放射状生长，免疫荧光示细胞胞浆中较强的红色荧光，呈与细胞纵轴平行的丝状排列，而细胞中心卵圆形细胞核未着色。 (2)我们用免疫荧光分析了MSC-EXO对低氧损伤PASMC及PAEC模型中Wnt5a表达的影响，结果表明，当细胞缺氧暴露72h时，Wnt5a的表达在缺氧诱导的PAEC和PASMC中显著降低，这种降低在MSC-EXO组中恢复(P＜0.05)。 (3)为了研究Wnt5a通路在骨髓间充质干细胞EXO中的作用，通过转染Wnt5asiRNA基因使Wnt5a基因沉默。转染WntSasiRNA导致Wnt5a表达减少，在PAEC和PASMC中，在mRNA水平的抑制效率分别为约96.4％和92.8％，在蛋白水平的抑制效率分别为50.8％和70.4％。 (4)内皮细胞缺氧暴露48h和72h后，流式细胞仪AV-PI染色检测凋亡:与对照组相比，缺氧组凋亡细胞的百分比逐渐增加，而MSC-EXO组的凋亡细胞的百分比低于缺氧组(P＜0.05);与MSC-EXO相比，Wnt5asiRNA转染组凋亡细胞的百分比明显增加(P＜0.05)。Westernblot及PT-PCR结果表明:缺氧72h后，与对照组相比，缺氧组抗凋亡基因Bcl2的mRNA和蛋白表达水平减少，促凋亡基因caspase-3和Bax增加;与对照组相比，MSC-EXO组抗凋亡基因Bcl2的mRNA和蛋白表达水平增加，促凋亡基因caspase-3和Bax降低;而Wnt5asiRNA转染组抗凋亡基因Bcl2的mRNA和蛋白表达水平减少，促凋亡基因caspase-3和Bax增加，即Wnt5asiRNA转染增加了细胞凋亡。 (5)BrdU法测定PASMC及PAEC的增殖结果表明:与对照组相比，低氧可使PASMC及PAEC的增殖显著提高(P＜0.05);与低氧暴露相比，MSC-EXO可使低氧暴露48h和72h的PASMC及PAEC的增殖显著降低(P＜0.05);而与MSC-EXO组相比，Wnt5asiRNA转染可使PASMC及PAEC增殖提高(P＜0.05)。Westernblot检测PAEC增殖细胞核抗原PCNA蛋白表达结果显示:低氧72h处理后，与对照组相比，缺氧组PCNA蛋白水平明显增高;与缺氧组相比，MSC-EXO组PCNA蛋白水平明显降低(P＜0.05);而Wnt5asiRNA转染与MSC-EXO组相比，PCNA蛋白水平增高(P＜0.05)。 (6)PAEC小管形成实验结果表明:缺氧72h后，与对照组相比，缺氧组成管和毛细血管网分支明显减少;与缺氧组相比，MSC-EXO组的成管和毛细血管网分支明显增强;但当细胞转染Wnt5asiRNA后，成管和毛细血管网分支明显减少(P＜0.05)。Transwell实验示:与对照组相比，缺氧组迁移细胞数明显减少;而与缺氧组相比，MSC-EXO组迁移细胞数明显增多(P＜0.05);与MSC-EXO组相比，Wnt5asiRNA转染组迁移细胞数明显减少。 (7)免疫荧光和Westernblot检测MSC-EXO对低氧PAEC细胞间质化的影响结果显示:与对照组相比，缺氧组CD31和VE-cad水平较低，而α-SMA水平较高;与缺氧组相比，MSC-EXO组CD31和VE-cad水平较高，而α-SMA水平较低(P＜0.05);转染Wnt5asiRNA后，与MSC-EXO组相比，CD31和VE-cad水平较低，而α-SMA水平较高。 (8)Westernblot检测Westernblot检测BMPR信号通路相关蛋白的表达:与对照组相比，缺氧组BMPR2、P/T-Smad1/5/8、BMPR4及BMPR9蛋白表达降低(P＜0.05);与缺氧组相比，MSC-EXO组BMPR2、P/T-Smad1/5/8、BMPR4及BMPR9蛋白表达显著升高(P＜0.05)，P/TSmad2/3及TGF-β1蛋白表达显著降低(P＜0.05);转染Wnt5asiRNA后，BMPR2、P/T-Smad1/5/8、BMPR4及BMPR9蛋白表达降低，P/TSmad2/3及TGF-β1蛋白表达升高(P＜0.05)。 5、研究结论 1、MSC-EXO可以显著降低MCT引起大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥大指数，减轻肺血管重塑和肺组织纤维化。 2、MSC-EXO能够降低低氧诱导PAEC的凋亡，抑制低氧诱导PASMC及PAEC的增殖，促进低氧诱导PAEC的迁移及管的形成。 3、MSC-EXO可以抑制肺动脉高压的血管重构，这可能是通过调节Wnt5a和/或BMPR2信号通路，然后抑制EndMT过程实现的。
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