摘要
1研究背景 动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovASCular disease，ASCVD)是一类以动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)为病理基础的疾病的总称，包含脑卒中、冠心病和外周动脉疾病等。ASCVD是目前导致我国人口死亡和残疾的首要原因，给我国造成了沉重的社会负担，已成为我国重大的公共卫生事件。尽管医学的不断进步，AS的防治策略仍有待完善。因此，进一步深入研究AS的发病机制，探寻新的治疗靶点，对于提高我国ASCVD的防治疗水平具有重要意义。 巨噬细胞是AS斑块中的主要细胞群，在AS的发生发展中起重要作用。巨噬细胞摄取脂质并转化为泡沫细胞，标志动脉粥样硬化病变的形成。巨噬细胞泡沫化加重了斑块的脂质负荷、炎症反应和斑块不稳定性。因此，如何减少巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质沉积，是治疗AS的一个重要靶点，一直备受科学家的关注。近年研究发现，自噬-溶酶体系统在AS的发生和发展过程中起到重要作用。溶酶体作为细胞的“废物处理系统”，是细胞处理和降解废弃或未被利用物质的主要场所。自噬是细胞以溶酶体为最终降解场所的一种分解代谢过程。自噬在调控脂质分解代谢中的重要作用是过去十多年中一个令人鼓舞的发现。自噬通过调控脂滴分解代谢和脂质排出降低细胞的脂质负荷。这些研究催生了“脂噬(Lipophagy)”这一概念，指脂滴通过自噬途径运输到溶酶体，在溶酶体酸性水解酶的作用下发生分解代谢的过程。促进脂噬过程是促进脂质代谢和胆固醇逆转运的重要途径。目前在AS领域中，关于自噬和脂质代谢关系的研究方兴未艾。根据降解底物运输到溶酶体的方式不同，自噬被人为的分为三种形式:大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。三种自噬共存于真核细胞中，共同维持细胞稳态。其中，大自噬和分子伴侣介导的自噬(以下简称CMA)对哺乳动物细胞尤为重要。大自噬即我们平常所说的自噬，也是目前研究最为成熟的一种自噬。在过去10年中，已经充分证明大自噬参与了AS的发生和发展。自噬通过改善内皮功能、促进巨噬细胞脂质代谢、降低斑块脂负荷和减轻斑块炎症等机制发挥抗动脉粥样硬化作用。然而人们对另一种自噬过程，即CMA在AS中的作用，知之甚少。 CMA是不同于大自噬的另一种自噬过程。两者的差异主要体现在底物选择和运输方面。大自噬对底物选择缺乏特异性，其降解底物包含长寿蛋白、受损细胞器、脂滴和糖等成分;而CMA是一种具有严格选择性的自噬类型，其降解底物为胞质中带有特定标签(KFERQ序列)的蛋白质。CMA对底物的运输不需要大自噬过程中的典型双层膜性结构，而是通过热休克蛋白70(Hsc70)结合底物进而运送到溶酶体，与溶酶体膜上的LAMP-2A结合，进入溶酶体进行降解。相比于大自噬，CMA的选择性使其可精确有效地降解参与细胞生命活动的关键蛋白。近年发现，CMA参与调控肝细胞糖和脂代谢，如CMA通过促进脂滴相关蛋白的降解促进脂质分解代谢。这些研究将CMA和大自噬在脂质代谢中的作用联系起来，使得CMA成为调控脂噬过程的关键上游因子，为人类脂质代谢异常相关疾病提供了新的线索。 目前，CMA在AS以及其他心血管疾病中尚无报道。由于动脉粥样硬化是一种以脂质代谢紊乱和慢性炎症为病理基础的疾病，以及CMA在肝脏糖脂代谢和免疫反应中的重要作用，我们推测CMA可能与AS的发病机制密切相关。因此，我们提出以下科学问题:在AS斑块中，哪种细胞主要承担CMA的功能？AS进展过程中，CMA如何变化？干预CMA是否影响AS进程？CMA在AS中的作用是否与调控巨噬细胞脂质代谢有关？ 本课题的研究有助于人们加深认识自噬-溶酶体系统在动脉粥样硬化中的作用，发现动脉粥样硬化新的发病机制，为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点。 2研究目的 (1)探讨CMA在AS进程中的动态变化; (2)探讨干预CMA对AS的影响。 (3)探讨干预CMA后对巨噬细胞泡沫化的影响，分析CMA影响AS的机制。 3研究方法 3.1构建小鼠AS进展模型 给予ApoE-/-小鼠不同时间高脂饮食，分别高脂喂养8周、12周、18周、24周和38周，在小鼠主动脉根部分别构建早、中、晚期斑块模型。 3.2临床冠状动脉标本 人体冠状动脉标本来自于本实验室冻存的尸检标本。标本经固定、包埋、冰冻切片。 3.3构建巨噬细胞LAMP-2A基因特异性敲除小鼠 LAMP-2A是CMA的限速蛋白，针对LAMP-2A进行基因干预是目前研究CMA的最可靠手段。分别在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠背景中构建巨噬细胞LAMP-2A特异性敲除小鼠，在体内阻断CMA过程，研究CMA对小鼠AS的作用及分子机制。 3.4一般检测指标 检测小鼠摄食量、体重、血糖、血脂。 3.5组织病理学检测 (1)HE染色和油红O染色:HE染色观察斑块大体形态、结构和斑块面积;油红O染色观测斑块脂质成分和斑块面积。 (2)免疫组化:对连续切片进行免疫组化染色，检测斑块中巨噬细胞(MOMA-2或CD68)、平滑肌细胞(α-SMA)和LAMP-2A的表达。 (3)免疫荧光:免疫荧光检测巨噬细胞(MOMA-2或CD68)和LAMP-2A共定位情况。 3.6LAMP-2B和LAMP-2C多克隆抗体的制备 LAMP-2B和LAMP-2C兔多克隆抗体由AtaGenix实验室生产。分别针对小鼠LAMP-2B和LAMP-2C的胞浆尾端的氨基酸设计抗体。LAMP-2B，氨基酸399至413:FISYMIGRRKSRTGY。LAMP-2C氨基401至c端:YLIGRRKTYAGYQTL。 3.7小鼠腹腔原代巨噬细胞提取和培养 分别从对照组小鼠和LAMP-2A敲基因小鼠中提取腹腔原代巨噬细胞。给予油酸钠刺激诱导泡沫细胞形成;给予氯喹、MG132、leupeptin等刺激检测降解途径;给予巴佛洛霉素刺激检测自噬流水平;给予mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒转染检测自噬流水平。 3.8Westernblot 检测LAMP-2A、LAMP-2B、LAMP-2C、LAMP2、LAMP1、Atg5、Atg7、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、SR-A、CD36、LAL、perilipin2和β-actin的表达。 3.9泡沫细胞染色 用Bodipy493/503或Oil-red-O对脂滴进行染色，观察泡沫细胞的形成。 3.10统计学分析 定量数据表示为均数±标准误(mean±SEM)。首先对所有数据进行正态分布性检验。两组之间的比较采用独立样本t检验，三组以上采用单因素方差分析。p＜0.05被认为具有统计学差异。 4实验结果 4.1巨噬细胞是小鼠和人体斑块中表达LAMP-2A的主要细胞 对斑块中三种主要细胞成分巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞进行Westernblot分析，结果显示，LAMP-2A在巨噬细胞中高表达，在平滑肌细胞和内皮细胞中表达水平很低。主动脉根部切片免疫组化和免疫荧光显示，LAMP-2A主要与巨噬细胞共定位。免疫荧光进一步验证了在人体冠脉斑块中LAMP-2A和巨噬细胞高度共定位。 4.2斑块进展过程中伴随着LAMP-2A水平逐渐降低 研究结果显示，LAMP-2A在早期斑块(高脂8和12周)中含量较高，在中期斑块(高脂18周)出现降低，在晚期斑块中(高脂24和38周)含量明显降低。人体冠脉斑块免疫荧光显示，与狭窄程度较轻的早期斑块相比，严重狭窄的晚期斑块中LAMP-2A表达水平低下。 4.3构建巨噬细胞特异性敲除LAMP-2A基因小鼠并验证其敲除效率以及对大自噬的影响 为了研究CMA在AS中的作用，我们构建了巨噬细胞LAMP-2A基因特异性敲除小鼠。Westernblot显示，在腹腔原代巨噬细胞中LAMP-2A被完全敲除，而其他溶酶体膜蛋白如LAMP-2B、LAMP-2C和LAMP-1均无明显变化。免疫荧光显示，LAMP-2A在小鼠主动脉根部斑块中也未见表达。Westernblot和自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3腺病毒)转染技术显示，LAMP-2A敲除的巨噬细胞自噬流水平略有增加，说明阻断CMA功能后大自噬水平代偿性升高，这也说明LAMP-2A敲除未影响巨噬细胞的溶酶体功能。 4.4LAMP-2A基因敲除小鼠斑块进展明显加速 与对照组小鼠(L2Afl/fl/ApoE-/-小鼠)相比，LAMP-2A敲基因敲小鼠(L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠)的体重、血脂、血糖水平无明显差异。取材时原位影像显示，L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠主动脉弓及分支处斑块明显增多。大体油红O染色显示，L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠主动脉斑块增多。主动脉根部切片HE染色及油红O染色同样显示，L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠斑块面积增大。说明敲除LAMP-2A基因阻断CMA后，小鼠斑块进展加速。 4.5LAMP-2A基因敲除导致巨噬细胞泡沫化加重 通过BODIPY493/503或油红色O染色发现，与正常小鼠来源的巨噬细胞相比，在受到油酸钠的刺激时，LAMP-2A敲除的巨噬细胞转化为泡沫细胞的比例更高，且细胞内脂质沉积更为严重。 4.6CMA对脂质代谢的调控与PLIN2降解无关 MG132处理显著增加细胞中PLIN2(perilipin 2)蛋白水平。其他的溶酶体蛋白酶抑制剂对PLIN2蛋白的含量无影响。LAMP-2A基因敲除对巨噬细胞中PLIN2的水平无影响。 4.7CMA通过影响脂质相关的酶调控脂质代谢 LAMP-2A基因敲除促进巨噬细胞泡沫化的作用与清道夫受体(SR-A和CD36)和胆固醇外排受体ABCA1无关。LAMP-2A基因敲除导致巨噬细胞中ACSL1蛋白水平升高，LAL降低，提示CMA缺陷导致巨噬细胞脂质合成增强，脂质分解受损。 5结论 (1)巨噬细胞是AS斑块中承担CMA功能的主要细胞。 (2)AS进展伴随有CMA功能的降低。 (3)CMA缺陷导致AS进展加速。 (4)CMA缺陷导致巨噬细胞泡沫化加重，这是CMA影响AS的重要机制。
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