摘要
丁二酸是一种安全的天然化合物，在全世界范围内，它的年产量约为七万-九万吨，广泛应用于食品、农业、化工等领域。另外，丁二酸还可作为中间体或重要前体合成γ-丁内酯、四氢呋喃和生物可降解塑料聚丁二酸酯等重要化合物。因此，最近几十年来如何实现生物基丁二酸的高效生产逐渐成为国内外的研究热点。 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种十分重要的工业微生物，与乳酸克鲁维酵母、毕赤巴斯德酵母和多形汉逊酵母等一样均属非常规酵母，具有抗逆性强、可代谢油脂等独特的生理和代谢特征。近年来，随着合成生物学和基因编辑技术的快速发展，科学家们利用合成生物学及基因编辑技术已经成功构建出了包括生物柴油、有机酸、脂质及其衍生物和萜类等多种高附加值工业产品的解脂耶氏酵母细胞工厂，使得该酵母在食品、药品和生化能源等方面均具有巨大的应用潜力。特别地，解脂耶氏酵母三羧酸循环中心碳代谢能力十分旺盛，并能够耐受较低pH值，因此可作为生产丁二酸的理想平台。 然而，目前解脂耶氏酵母在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中的丁二酸产量仍然偏低。针对此问题，本研究从转运系统优化和代谢途径理性改造两方面入手，以实现解脂耶氏酵母利用葡萄糖高效生产和分泌丁二酸。首先，我们筛选表征了了五种解脂耶氏酵母内源的线粒体羧酸转运载体，并且发现YlDic转运蛋白可能对于丁二酸的合成具有促进作用。接着，我们又表征了九种不同来源的细胞膜羧酸转运蛋白，结果发现来自粟酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白SpMaelp能够显著增强丁二酸的外排和分泌。另外，我们通过对丁二酸生物合成相关的三条代谢途径代谢工程改造，构建了一个丁二酸生产性能较佳的底盘细胞PGC62-SYF。 最终，我们综合了转运系统与代谢途径的优化改造，构建了一株高效生产分泌丁二酸的工程菌株PGC62-SYF-Mae。该菌株以葡萄糖为唯一碳源，进行分批补料发酵时，丁二酸最终产量达101.4g/L，生产力为0.70g/L/h，葡萄糖转化率为0.37g/g。这也是目前在真核微生物中以葡萄糖为唯一碳源的丁二酸最高产量。我们的研究结果表明了转运蛋白工程是实现解脂耶氏酵母高效分泌丁二酸的有效策略，可进一步促进生物基丁二酸的工业化水平。
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