摘要
随着社会的发展，能源危机日益严重;而且由于稻草秸秆的焚烧，造成了严重的环境问题。如果能利用微生物分泌的纤维素酶和木聚糖酶将稻草等植物纤维转化为能被人类使利用的能源和资源，就可以变废为宝，缓解能源和环境问题。哈茨木霉NJAU4742是一株能够高效降解木质纤维素的丝状真菌，能够分泌大量的纤维素酶和木聚糖酶，如果利用其完成对稻草的可持续利用，既节约了资源又可缓解环境的压力。 本论文利用基础盐培养基，分析了哈茨木霉NJAU4742的胞外木质纤维素酶活力(包括内切葡聚糖酶和木聚糖酶)并分别以温度，接种量，培养时间，尿素，硫酸铵，磷酸二氢钾，氯化钙含量为变量，研究其最佳产酶条件，结果表明:哈茨木霉NJAU4742产内切葡聚糖酶的最佳单因子条件为温度28℃，接种量105个·mL-1，时间5天，尿素0.3g·L-1，硫酸铵1.4g·L-1，磷酸二氢钾2g·L-1，氯化钙0.5g·L-1。利用正交设计助手设计实验，优化哈茨木霉NJAU4742产内切葡聚糖酶的条件，最终得到哈茨木霉NJAU4742产内切葡聚糖酶的最佳培养条件为温度29℃，培养时间5天，接种量105个·mL-1，尿素0.3g·L-1，硫酸铵1.4g·L-1，磷酸二氢钾2.5g·L-1，氯化钙0.4g·L-1。在该最佳条件下，内切纤维酶活力为4.93U·mL-1。 通过单因子试验得到哈茨木霉NJAU4742产木聚糖酶的最佳单因子条件为温度28℃，pH3.0，接种量105个·mL-1，培养时间为7天，尿素0.25g·L-1，硫酸铵1.4g·L-1，磷酸二氢钾2g·L-1，氯化钙0.4g·L-1。利用minitab和DesignExpert软件，进行实验设计及方差分析，找到影响产酶的核心因子，并以核心因子为条件设计实验，进行数据分析，最终找到木霉产木聚糖酶的最佳条件为温度28℃，初始pH3.16，接种量105个·mL-1，培养时间7天，尿素0.29g·L-1，硫酸铵1.4g·L-1，磷酸二氢钾2.12g·L-1，氯化钙0.35g·L-1。在该条件下，木聚糖酶活力为19.86U·mL-1，为条件优化之前的1.25倍;而且蛋白含量提高到优化之前的1.5倍。 根据哈茨木霉NJAU4742全基因组测序及相关纤维素酶基因的表达水平，挑出几个表达量比较高的纤维素酶基因在毕赤酵母中进行异源表达，以期对木霉纤维素基因的后续研究提供便利。目前，已经将四株纤维素酶基因A1A104288.1、A1A110863.1、A1A112192.1、A1A107670.1(其中A1A104288.1、A1A110863.1为内切葡聚糖酶基因，A1A112192.1、A1A107670.1为β-葡萄糖苷酶基因)成功克隆并转化到毕赤酵母中，然后对其进行诱导表达和SDS-PAGE电泳验证。表达后各自的酶活分别达到了2.28U·mL-1，2.99U·mL-1，0.079U·mL-1，0.131U·mL-1。蛋白含量达到5.21mg·mL-1，8.82mg·mL-1，4.38mg·mL-1，9.32mg·mL-1。 但是，对于这四个基因的作用机制还不够清楚，需要后期进行进一步的研究。而且在哈茨木霉NJAU4742的基因组中存在着大量的纤维素酶基因和木聚糖酶基因，它们的表达对于菌株产酶以及有机废弃物的降解都具有很大的作用，对于它们的研究也需要在今后的试验中慢慢探索。
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