摘要
研究背景与目的 肺癌是目前在全世界范围内发病率及死亡率最高的肺部恶性肿瘤之一，并且是我国癌症死亡的首要原因，每年约有150多万肺癌患者死亡。2015年在美国约有15.8万人死于该病。大多数患者就诊时已为局部晚期或远处转移，治疗效果不是很理想，所以迫切地需要我们探索一种更为有效的治疗手段。临床上肺癌的病理分型大体可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中大约85％的肺癌病理类型为非小细胞肺癌(NSCLC)。对于肺癌的治疗方法目前主要采用的方法有传统的手术切除肿瘤及引流区域淋巴结、放疗、化疗等，但疗效有限;近来出现了靶向药物治疗，但靶向药物耐药并不少见，2年来免疫治疗异军突起，但远期疗效有待进一步观察。手术为早期肺癌最好的治疗手段。随着社会的发展变化，目前肺腺癌已经成为肺癌最常见的组织病理学类型，约占非小细胞肺癌(NSCLC)发生率的50％，通常发生于肺外周的腺上皮细胞，源于Ⅱ型肺泡上皮细胞或支气管肺泡干细胞。肺腺癌一般起源于肺组织外周。肺腺癌的病因至今尚不完全明确，肺腺癌的主要危险因素是吸烟或被动吸烟(被动吸烟者的风险相对较高)、暴露于香烟烟雾、石棉、铬或砷化合物。肺腺癌患者通常预后较差，因为肺腺癌常在晚期才得以明确诊断，其转移是造成生存率低及预后差的主要原因，治疗过程中的耐药也是一个重要方面。总体而言，肺腺癌患者总的生存率并未因手术和放化疗技术的发展而有显著提高;其总体5年生存率约为16％左右。因此，迫切需要先进有效的治疗手段。近年来，随着科技的发展和进步，对肺腺癌相关基因和蛋白进行了许多研究，已经发现了许多与肺腺癌相关的基因突变和异常。针对突变基因的靶向药物治疗已成为肺腺癌治疗的重要方法之一。 肿瘤的发生、生长、侵袭和转移与基因有关，是恶性转化和肿瘤进展的分子遗传学基础。然而，对于一些新的基因及其与肺腺癌的关系研究较少。因此，识别与肿瘤发生相关的关键基因或靶点，可以引领我们进入到肺腺癌治疗的新阶段。增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene，HSG)，定位于线粒体外膜，在线粒体融合、运输、线粒体自噬等过程中发挥着至关重要的作用。此外，HSG在体外和体内都是细胞增殖的强抑制因子，能明显地抑制心血管疾病时的细胞增殖、迁移和再塑，减缓心血管疾病的进展。而且，HSG在胃癌、结直肠癌及肝细胞癌等消化道肿瘤及乳腺癌等多种恶性肿瘤中的抗增殖和诱导凋亡的功能也已经有所研究。 尽管有强有力的相关证据表明HSG可抑制肿瘤的发生，但是，HSG对肺腺癌A549细胞凋亡和增殖的影响以及体内实验数据缺乏系统的研究。因此，本研究拟通过构建RNAi慢病毒载体沉默HSG基因，构建裸鼠异种移植瘤，分别在体外和体内实验研究中初步探讨HSG基因沉默对肺腺癌A549细胞凋亡和增殖的影响，为今后肺腺癌的治疗探索新的方向。 方法 1.构建RNAi慢病毒载体沉默HSG基因。 1.1上海GeneChem公司设计与合成HSG特异性干扰RNAi序列、阴性对照序列、shRNA序列，利用慢病毒载体pLKO.1构建表达载体，将测序正确的慢病毒表达载体联合包装质粒载体共转染293T细胞后得到高浓度的病毒簇，进行有关病毒生物学滴度变化的检测。 1.2将病毒感染人肺腺癌A549细胞，用荧光显微镜计算感染效率。将细胞划分为3组，分别为Blank组(即空白组)，si-NC组(即阴性对照组)、si-HSG组(即HSG特异性干扰RNAi组)。显微镜下观察细胞生长情况。 1.3采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组细胞的HSG的mRNA表达。 1.4Westernblot方法检测各组细胞中HSG的蛋白表达。凋亡相关蛋白的表达。 2.各组细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的检测 2.1采用细胞计数试剂盒CCK)-8测定各组A549细胞增殖状态。 2.2流式细胞术碘化丙啶染色(PI)检测细胞周期。 2.3流式细胞术膜联蛋白Ⅴ-荧光素异硫氰酸酯双重染色(AnnexinⅤ-FITC)对A549细胞进行凋亡检测，应用流式细胞仪对各组细胞凋亡发生率及细胞周期数据进行分析。比较各组A549细胞周期情况及其细胞凋亡情况。 3.移植瘤构建及其检测 3.1选用BALB/C裸鼠建立异种移植瘤模型，分为Blank组、sh-NC组、sh-HSG组，造模成功后每5天进行一次肿瘤大小的测量，计算肿瘤体积并绘制其生长曲线图，32天时取下瘤体称重，比较每组小鼠的肿瘤生长情况。 3.2免疫组化检测各组小鼠的移植瘤瘤体组织HSG蛋白表达情况。 3.3TUNEL法检测各组肿瘤瘤体组织细胞的凋亡状态，计算细胞凋亡指数。 结果 1.HSG基因的RNAi慢病毒载体模型建立后，各组mRNA及蛋白检测结果 1.1RT-PCR方法对各组细胞中的HSG的mRNA表达进行检测，结果示与空白组相比较，si-NC组HSGmRNA表达无显著性差异(P＞0.05)，但si-HSG组HSGmRNA表达下降了38％(P＜0.05)，存在显著性差异。 1.2Westernblot检测各组细胞HSG的蛋白表达，结果显示，与空白组相比较si-HSG组中HSG蛋白表达明显减低，下降了46％(P＜0.05)。si-NC组与空白组HSG的蛋白表达则无显著性差异(P＞0.05)。可见si-HSG组HSG的mRNA和蛋白的表达降低。 1.3显微镜下观察各组细胞培养48h后结果示Blank组与si-NC组细胞状态生长良好，呈贴壁生长，细胞增殖的速度快，胞浆均饱满透亮，细胞形态以椭圆形和梭形为主，细胞和细胞间呈紧密连接，细胞状态生长良好。si-HSG组细胞与Blank组和si-NC细胞相比，细胞增殖速度进一步加快。 2.1采用CCK-8法检测HSG沉默对细胞增殖的影响结果 与空白组相比，si-NC组A549细胞在24、48、72h细胞增殖率无显著差异(P＞0.05)。与空白组及si-NC组相比，si-HSG组在24h、48h、72h细胞存活率均有显著提高(P均＜0.05)。不同时间点的比较结果示，与0h相比，各组细胞24h、48h、72h的细胞存活率均上升，(P均＜0.05)。与24h相比，各组细胞48h、72h的细胞存活率均上升，但无统计学意义(P＞0.05)。与48h相比，各组细胞72h时的细胞存活率均有所上升，但差异无统计学意义(P＞0.05)，沉默的HSG在24、48、72h时mRNA和蛋白表达升高，A549细胞存活率升高。体外HSG沉默可增强肺腺癌A549细胞的活力，细胞存活率增加。 2.2流式细胞术对HSG基因沉默后各组细胞的细胞周期检测结果 si-HSG组G0/G1期细胞比例较空白组明显减低，G2/M、S期细胞比例明显高于空白组(P＜0.05)。si-NC组和空白组在G0/G1、S期及G2/M期的细胞比例(P＞0.05)相比无显著性差异。表明HSG表达的下调可能使位于G0/G1期的细胞比例减少，G2/M期细胞的比例增加，促进了A549细胞的增殖。 2.3流式细胞术对HSG沉默后A549细胞的凋亡检测结果 空白组和si-NC组存在较多的早期凋亡和晚期凋亡细胞，在si-HSG组中观察到A549细胞早期凋亡和晚期凋亡的数目均显著降低。统计结果显示，与空白组相比，si-HSG组的细胞凋亡率有明显下降(P＜0.05)，而空白组与si-NC组之间的细胞凋亡率差异没有统计学意义(P＞0.05)。 2.4RT-PCR和Westernblot检测HSG沉默对细胞凋亡有关蛋白质表达结果 与空白组相比，si-NC组Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的mRNA和蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。si-HSG组Bax，Caspase-3，Caspase-8的mRNA和蛋白表达明显降低，但与空白组相比，si-HSG组的Bcl-2mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05)，存在显著性差异。HSG沉默可降低A549细胞Bax、Caspase-3和Caspase-8的表达，增加Bcl-2的表达。 3.HSG沉默后体内实验结果 3.1随着时间的增加，各组裸鼠移植瘤的体积均显著地增加(P＜0.05);与空白组相比，sh-NC组在各个不同时间点移植瘤体积增大，但无显著性差异(均P＞0.05)，sh-HSG组与空白组及sh-NC组相比各时间点肿瘤体积均有显著增加(均P＜0.05)，32d时移植瘤称重，与空白组相比，sh-NC组移植瘤质量无显著性差异(均P＞0.05)，sh-HSG组与空白组及sh-NC组相比肿瘤质量均有显著增加(P＜0.05)。 3.2免疫组化法检测各组肿瘤组织中HSG蛋白的表达结果显示，HSG阻性反应物在肿瘤细胞胞浆和细胞核内常常显示为一棕黄色小球状染色颗粒。分析各组的平均光密度值(optical density，OD)，结果示空白组与sh-NC组之间的HSG蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。与空白组相比，sh-HSG组中HSG蛋白表达显著降低(P＜0.05)，存在显著性差异。 3.3TUNEL染色检测各组瘤体组织的凋亡情况，在显微镜下，凋亡细胞主要表现为细胞核浓缩成均匀的致密物质，颜色为棕黄色。空白组和sh-NC组凋亡细胞较少。sh-HSG组凋亡细胞明显减少。经统计学分析，空白组与sh-NC组间的细胞凋亡指数(AI)差异不具有统计学意义(P＞0.05)，sh-HSG组与空白组相比，AI有明显降低(P＜0.05)，差异具有有统计学意义。 结论 1.HSG沉默可使肺腺癌A549细胞增殖速度增加，细胞存活率增加，细胞凋亡率降低。 2.HSG沉默可下调A549细胞Bax，Caspase-3，Caspase-8mRNA和蛋白的表达，上调Bcl-2的mRNA和蛋白表达。 3.HSG沉默后肺腺癌A549细胞在裸鼠体内的增殖速度明显加快;细胞的凋亡指数降低，会抑制肿瘤细胞的凋亡。 4.HSG基因沉默可能是促进肺腺癌进展的一个因素。HSG可能是肺腺癌进展过程中的一个抑癌基因，是研究肺腺癌过程中的一个非常值得关注的基因。
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