摘要
致病疫霉属于卵菌纲、霜霉日、疫霉属，其侵染马铃薯引起的马铃薯晚疫病，导致马铃薯茎、叶的坏死和块茎腐烂，是全球农业生产上的一种毁灭性病害。马铃薯晚疫病曾于19世纪中期在爱尔兰大爆发，导致上百万人饿死，史称爱尔兰大饥荒。目前，马铃薯晚疫病在我国的发生十分普遍，每年都对农业生产造成巨大的经济损失。虽然，推广抗病品种的种植可减轻马铃薯晚疫病的危害，但是由于马铃薯晚疫病菌的变异速度快，田间产生的新的生理小种可克服马铃薯的品种抗性。因此，化学防治依旧是农业生产上防控马铃薯晚疫病的重要措施。 组蛋白H3上第27位赖氨酸的三甲基化修饰H3K27me3是一种与基因转录抑制相关的表观修饰，该修饰会改变染色质的结构，使其变得更为致密紧缩从而抑制基因的表达。H3K27me3修饰在真菌、植物、动物和人类中都十分保守，影响着包括发育、分化和免疫等许多生物学过程。在拟南芥、果蝇等模式生物中的研究证实PRC2复合体催化组蛋白H3K27的三甲基化修饰，复合体中的E(z)亚基是具有催化活性的甲基转移酶。化学分子GSK126是一种靶向E(z)的特异性组蛋白H3K27me3化学抑制剂，其通过与甲基供体腺苷甲硫氨酸SAM竞争性结合E(z)亚基来抑制E(z)的酶活性。然而，GSK126对于疫霉菌的防治作用至今还没有被研究过，针对该科学问题，本文围绕GSK126对疫霉菌的生理生长抑制效果及其对于杀菌剂霜霉威药效的影响开展了以下研究。 H3K27me3修饰的检测及E(z)同源基因的挖掘与序列分析。首先我们通过Westernblot实验，证实致病疫霉和大豆疫霉中均存在组蛋白H3K27me3修饰，并且通过与果蝇及人类的序列同源比对，在致病疫霉中找到了5个E(z)同源基因，在大豆疫霉中找到了7个E(z)同源基因。通过构建系统发育进化树，发现致病疫霉PITG_02096T0和大豆疫霉Ps_144554与果蝇E(z)的亲缘关系最近，且均含有保守的SET功能域。另外，通过对6个致病疫霉小种的E(z)同源蛋白SET功能域的序列进行比对，我们发现致病疫霉的E(z)同源蛋白PITG_10068T0、PITG_12169T0、PITG_02096T0、PITG_13838T0、PITG_13837T0的氨基酸序列在SET功能域内高度保守。结合转录本数据，本研究证明了在致病疫霉中存在能够表达的E(z)保守同源基因，推测可能参与致病疫霉的组蛋白H3K27me3的调控。 致病疫霉和大豆疫霉对GSK126的敏感性测验。由于GSK126能够靶向人类PRC2复合体中的E(z)同源蛋白EZH2，并且对一些肿瘤细胞系的生长及其H3K27me3修饰有着显著的抑制效果。而在致病疫霉和大豆疫霉中也存在E(z)的同源基因，于是我们推测GSK126也可能通过靶向疫霉菌E(z)蛋白进而影响这两种疫霉的生理生化过程。我们首先通过生长速率法测定了致病疫霉和大豆疫霉对GSK126的敏感性，发现GSK126对致病疫霉菌株生长抑制率的EC50值为177.9μM，对大豆疫霉P6497菌株生长抑制率的EC50值为107.6μM。我们近一步通过Westernblot证明100μM的GSK126对致病疫霉和大豆疫霉的组蛋白H3K27me3修饰水平均有较强的抑制效果。随后我们通过SWISS-MODEL网站对疫霉菌E(z)同源蛋白与GSK126的互作结构进行了模拟预测，发现利用大豆疫霉的E(z)同源蛋白Ps_117600可以找到带有GSK126分子的蛋白结构模板，并模拟出Ps117600的三维结构以及四个可能与GSK126互作的氨基酸残基，其中一些残基在检测的致病疫霉T30-4菌株的E(z)同源蛋白序列中高度保守。 GSK126与霜霉威混配对致病疫霉的抑制效果。霜霉威是一种氨基甲酸酯类的杀菌剂，具有局部内吸作用，可抑制病菌细胞膜成分的磷脂和脂肪酸的生物合成，对于马铃薯晚疫病、辣椒疫病和烟草黑胫病等卵菌病害有较好的防治效果，目前在农业疫病防治中大量使用。考虑到GSK126可通过影响H3K27me3的修饰进而改变疫霉菌基因组的表观遗传状态，推测该化合物可能会影响疫霉菌对霜霉威的敏感性，因此本研究进一步测定GSK126与霜霉威是否存在协同增效的作用，探讨其协同防治的成效。我们首先通过生长速率法测定了致病疫霉对霜霉威的敏感性，霜霉威对致病疫霉T30-4菌株生长抑制率的EC50值为10.17μg/mL。进一步我们使用终浓度为93.69μg/mL的GSK126与霜霉威混配并测定其对致病疫霉菌丝生长的抑制率，根据Horsfall方法，利用抑制率计算出混配药剂的毒性比率，发现GSK126与霜霉威混配具有增效作用。今后课题组还将进一步针对该现象进行深入研究，并探讨表观抑制剂与化学农药联用的协同增效作用，可为今后的病害防控提供一种新的思路。
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