摘要
猪肠道是猪体内最大的消化和吸收器官，近几年由于各种原因引起的肠道炎症，造成了大量猪场仔猪存活率降低、畜牧相关产品产量降低，给养殖行业带来严重的经济损失，卫生安全问题也越来越受到各界的关注。动物肠炎的发病机制尚不明了，但已有文章报道肠道黏膜免疫系统的紊乱以及菌群失调在动物肠炎的发病过程中发挥着十分重要的作用。关于肠道微生物对猪肠道干细胞增殖和再生的研究知之甚少。在本研究中，我们使用小鼠模型探究乳酸菌修复病原菌引起损伤的机制，为探究乳酸菌改善仔猪肠道炎症机制奠定基础。我们发现枸橼柠檬杆菌和沙门氏菌均可以引起小鼠的肠道炎症以及隐窝的过度增殖，罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌4356轻微地通过调控隐窝的增殖保护肠上皮屏障的完整性，避免隐窝的过度增殖。乳酸杆菌通过维持Lgr5阳性肠道干细胞的数量，合理地刺激肠上皮的增殖减少肠上皮的损伤，并且降低肠道的促炎因子的产生。由于猪的类器官模型建立尚不成熟，我们建立小鼠类器官与罗伊氏乳杆菌的共培养模型，我们发现罗伊氏乳杆菌可以通过提高R-spondins表达并且因此活化Wnt/β-catenin信号通路刺激肠上皮的增殖。在肿瘤坏死因子(TNF-α)的损伤状态下，乳酸菌仍然能够维护肠上皮的增殖以及Lgr5阳性干细胞的数量。最后我们发现罗伊氏乳杆菌能够调控仔猪的肠道干细胞增殖和免疫功能维持肠黏膜屏障。本研究证明乳酸杆菌能够有效地维护肠上皮的再生和稳态，并且在肠道病理损伤状态下可以起到保护作用，为阐明罗伊氏乳杆菌作为一种有前景的治疗肠道炎症替代疗法奠定理论基础。本研究分为以下四个部分: 1、乳酸杆菌体内调控肠道干细胞增殖维护肠道屏障 为探究乳酸杆菌在体内对于肠道炎症的保护效果，我们分别选用两株乳酸菌罗伊氏乳杆菌D8和嗜酸乳杆菌4356，两株经典的小鼠肠道致病菌枸橼柠檬杆菌和鼠伤寒沙门氏菌SL1344。体外抑菌圈试验表明罗伊氏乳杆菌较嗜酸乳杆菌对枸橼柠檬杆菌的拮抗效果更好，而嗜酸乳杆菌较罗伊氏乳杆菌对SL1344的拮抗效果更为明显。因此我们在体内试验中分别探究罗伊氏乳杆菌D8对枸橼柠檬杆菌引起肠炎的修复状况，嗜酸乳杆菌4356对鼠伤寒沙门氏菌引起肠炎的修复的状况。 为了证实罗伊氏乳杆菌D8在体内改善肠道炎症的保护作用，C57BL/6小鼠口服灌胃罗伊氏乳杆菌D8。首先，我们发现用免疫荧光显微镜检测罗伊氏乳杆菌在肠道中的定殖，并通过CFU计数发现其在16h达到其峰值。此外，罗伊氏乳杆菌的定殖显著降低粪便中的枸橼柠檬杆菌的数量，以及减缓由枸橼柠檬杆菌感染引起的体重减轻和结肠长度的缩短。感染枸橼柠檬杆菌的小鼠的肠道变得透明。然而，罗伊氏乳杆菌D8能够大大减缓病理损伤，并维持正常的隐窝深度，以避免隐窝的过度增殖。枸橼柠檬杆菌感染引起小鼠肠道形态的病理改变，同时提高小鼠血清中LPS浓度和肠道中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量。而罗伊氏乳杆菌能够通过降低LPS表达水平以及促炎因子表达水平保护肠黏膜功能。枸橼柠檬杆菌会过度上调Lgr5以及PCNAmRNA的表达水平引起隐窝的过度增殖，而活罗伊氏乳杆菌D8能够通过对干细胞以及增殖基因的调控改善过度增殖。同时我们发现沙门氏菌能够引起明显的小鼠肠道炎症，包括结肠变短、粪便中载菌量上升以及肠道组织形态的改变，嗜酸乳杆菌4356能够显著改善肠道炎症，降低沙门氏菌的定殖以及改善肠道的病理状况。嗜酸乳杆菌4356能够通过调控干细胞以及增殖基因的表达避免沙门氏菌引起的肠道隐窝过度增殖。 2、罗伊氏乳杆菌通过在生理条件下激活Wnt/β-连环蛋白途径来增加肠类器官的增殖 由于猪类器官的模型尚未建立成熟，我们建立罗伊氏乳杆菌与小鼠类器官共培养模型。与空白组相比，罗伊氏乳杆菌D8处理能够增加肠类器官的表面积。此外，罗伊氏乳杆菌能够刺激肠上皮细胞增殖，提了c-Myc，cyclin和Ki67增殖基因mRNA表达量，在隐窝中使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色，增殖细胞显著增加同样验证了这一结果。实验结果表明，罗伊氏乳杆菌D8显著增加Wnt3和Lrp5的mRNA表达水平，激活Wnt/β-catenin通路，β-catenin和活性β-catenin表达的增加进一步证实该结论。同时我们发现，罗伊氏乳杆菌D8显著诱导活性β-连环蛋白的核积累。在罗伊氏乳杆菌D8激活Wnt/β-catenin途径后，共培养的类器官中ISCs标记基因(如活性ISCs标记物(Lgr5，Olfm4，Ascl2)和静息ISCs标记物(Bmi1，Msi1))的mRNA表达水平也增加。此外，与对照组相比，在罗伊氏乳杆菌处理的类器官中检测到Lgr5蛋白水平升高和Lgr5+免疫荧光细胞增加。进一步研究我们发现，在培养基中缺失R-Spondin-1，Wnt/β-catenin途径的激活受到抑制。有趣的是，即使培养基中缺乏R-Spondin-1，罗伊氏乳杆菌D8仍然可提高加Wnt3，Lgr5和c-Myc的mRNA表达。同时我们还发现罗伊氏乳杆菌D8可以增加R-spondin-1，R-spondin-2和R-spondin-3mRNA表达。这种现象也通过类器官中的EdU阳性细胞的数量得到证实。此外，罗伊氏乳杆菌对隐窝刺激增殖的作用比热灭活的乳酸杆菌作用更明显。 3、罗伊氏乳杆菌D8改善TNF-α诱导的肠炎 仔猪在受到各种外界刺激，会激活肠道免疫系统产生各种细胞因子，这些细胞因子会损伤猪的肠上皮细胞。因此在本实验中，我们使用TNF-α造炎症损伤模型，检测类器官在病理状态下，罗伊氏乳杆菌D8是否具有修复肠上皮损伤功能。在TNF-α处理后，超过80％的类器官出现明显损伤。然而，罗伊氏乳杆菌D8能够降低损伤的类器官的百分比和TNF-α的mRNA表达。罗伊氏乳杆菌能够提高增殖基因的表达，提高EdU阳性细胞光密度维持肠上皮细胞的增殖能力，修复损伤的肠上皮。与对照组相比，罗伊氏乳杆菌D8显著上调Wnt3和Lrp5基因的表达，该结果与β-连环蛋白的表达量增加一致。此外，罗伊氏乳杆菌显著改善干细胞标志基因Lgr5，Olfm4，Ascl2和Bmi1的表达。隐窝中Lgr5蛋白量和Lgr5+细胞的数量，该结果进一步证实罗伊氏乳杆菌能够在病理状态下维持肠道干细胞的稳定。这些结果表明罗伊氏乳杆菌维持由TNF-α抑制的Wnt/β-连环蛋白途径的活化，从而刺激肠上皮细胞的增殖。通过检测隐窝中Paneth细胞的数量和溶菌酶表达，显示TNF-α处理引起了Paneth细胞功能障碍。然而，罗伊氏乳杆菌D8可以恢复TNF-α对类器官损伤后引起的Paneth细胞的减少和溶菌酶表达的量的降低。 4、罗伊氏乳杆菌调控仔猪肠道增殖和免疫功能维持增强肠黏膜屏障 12头三日龄的梅花猪随机分成两组，空白组连续灌胃5天无菌PBS，每次2mL;罗伊氏乳杆菌D8组连续灌胃5天罗伊氏乳杆菌，109的乳酸菌溶于2mL无菌PBS。每日定时测量仔猪的体重，结果显示罗伊氏乳杆菌处理组在第二天和第三天与空白组相比出现显著的差异。HE染色显示，罗伊氏乳杆菌D8处理能够增加仔猪空肠的肠绒毛的高度以及隐窝深度，统计结果与HE图片显示结果一致。PCNA免疫组化结果表明，罗伊氏乳杆菌D8处理能够显著提高仔猪每个隐窝内PCNA阳性细胞数量。同时增殖基因c-Myc在罗伊氏乳杆菌处理之后有上调趋势(P=0.056)，罗伊氏乳杆菌D8也能够显著上调Wnt-β-catenin信号通路靶基因Tcf4的表达。该结果表明罗伊氏乳杆菌D8可能是通过激活Wnt-β-catenin信号通路来促进仔猪肠上皮的增殖。我们对仔猪空肠的muc-2以及lyz-1进行检测，发现罗伊氏乳杆菌D8能够增加仔猪muc2和lyz-1的基因表达水平。HE实验统计表明，罗伊氏乳杆菌能够显著提高仔猪回肠派尔氏斑的面积。荧光定量结果显示，罗伊氏乳杆菌D8能够提高Th1细胞分泌细胞因子基因IFN-γ和TH2细胞分泌细胞因子基因IL-4。以上结果表明罗伊氏乳杆菌通过激活Wnt-β-catenin信号通路促进肠上皮增殖，增加抗菌肽的分泌以及调控黏膜免疫功能，最终维护肠道的黏膜屏障功能。
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