摘要
猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是猪瘟(Classical swine fever，CSF)的病原，可引起猪亚临床到急性型等多种复杂临床症状。猪瘟的流行已有近二百年的历史，对食品安全造成威胁，影响了食品贸易，对全球养殖业造成巨大的经济损失。本研究实现了CSFVE2蛋白在昆虫细胞中的分泌表达，并进行了免疫特性研究，为CSFV亚单位疫苗的研究奠定了基础，具体研究内容如下: 1.CSFVE2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 为了建立CSFVE2蛋白间接ELISA检测方法，本研究将E2基因优化为大肠杆菌偏嗜密码子，并删除跨膜区基因，构建了大肠杆菌表达载体。SDS-PAGE和Westernblot鉴定，结果表明E2蛋白存在于超声裂解后沉淀，纯化重组E2蛋白可与His-tag单抗反应。以该抗原为包被抗原，建立了ELISA抗体检测方法，最佳反应条件为:抗原包被浓度8μg/mL，血清稀释度1∶50，酶标二抗稀释度1∶10000，显色时间为10min。判定标准为SOD450≥0.398判为阳性，SOD450＜0.338判为阴性，二者之间为可疑。该方法批内和批间重复变异系数分别为1.93％和6.11％，具备良好特异性，与常见猪传染病抗体无交叉反应，且与IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒相比，符合率达到84.5％，为猪瘟病毒血清学调查和免疫抗体检测提供了有用的方法。 2.表达CSFVE2蛋白的重组杆状病毒的构建及免疫特性研究 本研究以猪瘟病毒石门株E2基因为模板，通过蜂素信号肽和基因密码子优化，设计了2种E2基因分子(E2oKm和HE2oKm)，并与His标签融合，构建了三种重组杆状病毒rAc-E2、rAc-E2oKm和rAc-HE2oKm。Westernblot和IFA试验结果显示，三种重组杆状病毒均可正确表达重组E2蛋白，表达产物与抗E2蛋白单抗(7H2)和His-Tag单抗均有良好的抗原反应特性，其中rAc-HE2oKm可分泌表达重组E2蛋白并形成病毒样颗粒。将重组杆状病毒rAc-HE2oKm表达的E2蛋白分别与ISA15A和ISA206佐剂混合乳化，制备成水包油佐剂疫苗(E2-15A)和水包油包水双向佐剂疫苗(E2-206)，通过动物试验评价其免疫效果。间隔三周进行一次免疫，免疫后21天采集血清。兔免疫保护试验表明，两种亚单位疫苗都可以诱导兔体产生CSFV特异的免疫反应，在首免后21天可检测到ELISA抗体，加强免疫后抗体进一步攀升，达到较高水平，且E2-206组ELISA抗体及中和效价均高于E2-15A组，攻毒后两种疫苗均能提供保护力，抵御猪瘟C株的攻击。仔猪免疫试验结果显示，疫苗加强免疫后，E2-206组可诱导产生与弱毒活疫苗组(C-strain)相似的ELISA抗体及中和抗体，证明表达的重组E2蛋白具有良好免疫原性，ISA206免疫佐剂效果优于ISA15A，为CSFV新型亚单位的疫苗研制奠定了重要基础。
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