摘要
发酵糯米制品深受世界各国人民的喜爱，历史悠久，品类繁多。发酵糯米制品是以糯米为原材料，利用酒药在特定环境下发酵制得的食品。国内外对传统发酵食品的研究和开发已有多年，对发酵菌株探索和改良的研究日渐深入，对通过微生物发酵作用提高食品营养和功能活性的报道逐渐增多，新型的发酵食品也受到了越来越广泛的关注。茯砖茶是一种历经益生菌发酵的黑茶，内含复杂的微生物区系。其中，冠突散囊菌的生物量与茯砖茶的品质密切相关。目前已有国家标准限定，合格的茯砖茶中冠突散囊菌的活菌数必须大于2×105CFU/g。由于茯砖茶拥有天然的益生菌群，这些微生物具有较好的分泌胞外淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的能力，因而茯砖茶的天然微生区系具备了良好的发酵糯米的潜能。 本研究利用茯砖茶天然的微生物区系和酶系作为“曲”，与酒药混合发酵糯米，提出了一种新的糯米发酵方式，并探究了茯砖茶添加对糯米发酵效率和理化特性的影响，对发酵糯米品质的丰富和改善作用，对抗氧化活性、保护DNA氧化损伤活性和保护神经细胞氧化损伤活性的影响。本研究包括四部分内容，主要结果如下: 1.茯砖茶添加对糯米发酵过程及理化特性的影响 通过高通量测序分析茯砖茶中微生物的多样性:散囊菌属具有最大丰度，此外还发现曲霉属和酵母属的存在。研究进一步从茯砖茶中筛选出三株可培养丝状真菌，通过形态学观察和分子生物学手段鉴定为冠突散囊菌(Eurotiumcristatum，“金花菌”)、黑曲霉(Rhizopus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。茯砖茶具备了作为“曲”的特质，既含有丰富的活菌又含有复杂的酶系，因此，本研究利用茯砖茶天然的微生物区系和酶系与酒药混合发酵糯米(Mix fermented glutinous rice，MF-GR)，制得一种新型的功能性食品。以色值(L*、a*、b*)、发酵时间、汁液浸出率和感官评价等指标为优化依据，确定发酵工艺为:2％茯砖茶添加量与0.3％酒药混合发酵糯米。以酒药发酵糯米(Koji fermented glutinous rice，KF-GR)为对照，在0h至48h，分析了茯砖茶添加对糯米发酵过程中主要酶活力的影响，包括淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶:MF-GR的淀粉酶在发酵33h时活力达到最大，显著高于KF-GR;MF-GR的蛋白酶活力在发酵24h时达到最大，且在前27h发酵过程中显著高于KF-GR;MF-GR的脂肪酶活力随时间变化较小，与KF-GR的差异不显著;MF-GR在发酵过程中有β-葡萄糖苷酶的活力，发酵33h时达到最大，但KF-GR中未检测到β-葡萄糖苷酶活力。同样，在15h至48h，分析了茯砖茶添加对糯米发酵过程中主要理化特性的影响，包括pH值、总酸度、还原糖含量、可溶性固形物含量和酒精度，结果发现，MF-GR中微生物对基质的利用速率显著高于KF-GR，因而茯砖茶添加显著提高了糯米的发酵效率。本研究还探究了茯砖茶添加对发酵过程中酵母菌生物量的影响，结果发现，在MF-GR发酵过程中，酵母菌在18h左右进入对数生长期，42h时酵母菌生物量达到最大(7.1×106CFU/g);而KF-GR进入对数生长期较晚，且最大生物量为6.7×106CFU/g;在综合分析确定的发酵终点30h时，MF-GR和KF-GR中酵母菌的生物量分别为4.8×106CFU/g和3.9×106CFU/g。通过qPCR分析发酵前后MF-GR中益生菌冠突散囊菌的生物量，研究发现，茯砖茶添加混合发酵糯米有助于益生菌的富集。 2.茯砖茶添加对发酵糯米有机酸、短链脂肪酸和风味物质的影响 通过高效液相色谱法测定MF-GR和KF-GR中有机酸和短链脂肪酸的种类和含量。研究发现，MF-GR有机酸的种类和含量显著高于KF-GR，尽管MF-GR短链脂肪酸的含量显著小于KF-GR，但其种类比KF-GR丰富。其中，MF-GR中酒石酸、乳酸和丙酸含量显著高于KF-GR，而乙酸含量显著低于KF-GR，且MF-GR中检测到KF-GR中没有的苹果酸和丙酮酸，而甲酸、琥珀酸、草酸和柠檬酸的含量无显著性差异。通过电子舌技术测得MF-GR的咸味、涩味、酸味和鲜味强度显著低于KF-GR，MF-GR的总体风味较KF-GR更加柔和，但MF-GR的苦味、苦的回味和涩的回味高于KF-GR，这是由茯砖茶中多酚、黄酮、花青素、生物碱等特殊化合物影响的，此外，鲜的回味没有显著性差异。通过电子鼻技术检测到茯砖茶添加提高了醇类化合物、芳香族和烷烃类芳香物质的丰富度和强度，胺类、烯烃类和有机硫化物贡献的香气也存在差异。通过HS-SPME-GC-MS技术分析测定MF-GR和KF-GR中挥发性风味物质的组成和相对含量，共鉴定出94种挥发性风味物质(16种醇、11种酸、32种酯、11种醛、3种酮、2种醚、3种呋喃、2种萜烯、4种烃类、6种酚类化合物、3种芳烃和1种含氮化合物)，其中，有35种化合物是MF-GR中特有的香气成分。同时，研究应用模糊数学法进行感官评价分析，在色泽、气味、滋味、口感质地和综合方面，MF-GR的得分显著高于KF-GR。茯砖茶添加丰富了发酵糯米的香气和滋味，提高了发酵糯米的品质。 3.茯砖茶添加对发酵糯米体外抗氧化及保护DNA氧化损伤活性的影响 茯砖茶添加显著提高了发酵糯米的抗氧化能力。研究从ABTS自由基清除力、DPPH自由基清除力、铁离子还原能力、还原潜力、金属螯合能力和羟基自由基清除力六项抗氧化活性评价指标出发，分析比较了MF-GR和KF-GR的体外抗氧化能力差异，同时考察了二者对DNA氧化损伤的保护作用。研究选取两种提取试剂(去离子水和80％乙醇)分别提取MF-GR和KF-GR中的活性成分，结果表明80％乙醇溶剂比去离子水能提取到更多的酚类物质。除金属螯合能力评价，醇提物比水提物展现出更好的抗氧化能力。MF-GR的80％乙醇提取物具有较强的清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力，具有较好的铁离子还原能力和还原潜力，其EC50值分别是10.75±0.24μg/mL，15.97±0.21μg/mL，13.23±1.87μg/mL和126.42±3.83μg/mL，说明其抗氧化能力与阳性对照相仿。茯砖茶添加对发酵糯米抗氧化能力的提高不仅源于茯砖茶多酚，还与微生物发酵利用基质促进酚类物质的释放和转化关系密切。发酵后MF-GR含有的总酚含量(1.362±0.010mgGAE/g醇提物和0.821±0.009mgGAE/g水提物)显著高于未发酵的茯砖茶糯米，其总抗氧化能力(1.051±0.014mgGAE/g醇提物和0.628±0.012mgGAE/g水提物)也最为突出，其清除自由基和还原的能力以及保护DNA氧化损伤的程度显著优于未发酵样品。此外，通过高效液相色谱分析，茯砖茶添加显著提高了儿茶素等游离酚类化合物的种类和含量。通过皮尔森相关性分析可知，样品中酚类物质的种类和含量与其展现的抗氧化活性关系密切。 4.茯砖茶添加对H2O2诱导的神经细胞PC12氧化损伤保护作用的影响 通过建立H2O2诱导PC12神经细胞氧化损伤的模型，研究分析了茯砖茶添加提高了发酵糯米对PC12神经细胞氧化损伤的保护活性:比较了MF-GR和KF-GR提取物在100-500μg/mL浓度范围内对氧化损伤细胞存活率的影响(H2O2损伤组细胞的存活率为46.3％，在500μg/mLMF-GR提取物保护作用下，受氧化损伤的PC12细胞存活率为75.0％，显著高于KF-GR提取物的56.4％);借助倒置相差显微镜观察细胞形态，通过细胞荧光染色分析细胞的状态分布，发现MF-GR提取物比KF-GR更能有效保护细胞的完整性，维持细胞的正常形态;通过生化实验分析表明，茯砖茶添加可以显著提高对细胞内脂质过氧化的抑制作用，保护细胞膜免受氧化损伤，使其保持完整性，进而更有效地缓解了胞内乳酸脱氢酶的溢出情况;茯砖茶添加可以显著降低氧化受损细胞胞内活性氧的水平，缓解由氧化损伤引起的有丝分裂阻滞情况，降低凋亡酶Caspase-3的酶活力，进而减少由氧化损伤引起的细胞凋亡的发生;茯砖茶添加可以显著提高发酵糯米对细胞自身抗氧化系统的提升活性，包括提高抗氧化酶的活性、提高抗氧化肽的含量等。研究结果表明，MF-GR提取物展现出对PC12神经细胞氧化损伤的保护能力显著优于KF-GR提取物，且呈现一定的剂量依赖关系。
NETL