摘要
活性氧自由基是生物体内产生的信号分子，具有调节细胞内线粒体呼吸和酶促反应的重要功能，但随着生理机能的退化及紫外线、化学污染、辐射和空气污染等外界环境的影响，生物体内的活性氧自由基会逐渐积累并出现氧化应激反应。为了有效缓解氧化应激带来的生理损伤，合理补充抗氧化物质对维持生理健康具有重要意义。研究发现，植物、动物、微生物等天然原料中存在具有功能活性的肽类物质，其来源和活性与多肽本身的蛋白质来源、结构及氨基酸组成具有重要关系。干腌火腿作为一种具有渊源历史的肉制品，其感官风味、产品品质均得到了广大消费者的认可与好评。在干腌火腿加工过程中，肌肉中的蛋白质在内源酶的作用下发生降解并产生大量的多肽，多肽的形成不仅丰富了火腿风味，而且提高了火腿的功能品质。为了从功能性角度阐释火腿的蛋白质降解、抗氧化特性及活性多肽的吸收特点，本课题以云南宣威火腿为原料，利用体外消化、细胞模型等手段，开展了关于火腿中抗氧化肽的蛋白质组学分析、活性肽的纯化分离、细胞电化学方法的抗氧化评价及抗氧化通路的调节机制研究，为揭示宣威火腿抗氧化肽的消化特性、跨膜转运途径及抗氧化调节规律提供了理论支持，具体研究内容和结果如下: 1.宣威火腿中多肽的形成及抗氧化活性鉴定 本章以宣威和金华火腿为材料，采用浸提法提取火腿肌肉中的多肽成分，得到多肽粗提物，然后以谷胱甘肽(GSH)作对照，通过体外试验测定不同质量浓度粗肽液的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率、清除超氧阴离子自由基(O2-·)、ABTS自由基清除和氧自由基吸收能力(ORAC)，同时采用LC-ESI-Q-TOF-MS/MS方法鉴定多肽成分并借助PEAKS软件的DoNovo方法分析火腿中降解产生的多肽成分与源蛋白质的关系，从而确定活性多肽的蛋白质来源。研究结果显示，宣威和金华火腿多肽的DPPH、O2-·清除活性均随浓度的升高而增大。宣威火腿多肽的ORAC(949.97μmolTE/g)和ABTS值(148.97μmolTE/g)均高于金华火腿多肽。从宣威和金华火腿中分别鉴定出243条多肽和213条多肽，其源蛋白主要来自于肌球蛋白、肌钙蛋白和肌动蛋白。其中，两种火腿中具有相同的多肽序列，部分多肽序列的氨基端和羧基端有相似的肽链结构，从而说明两种火腿的蛋白质降解方式具有相似性。综合以上数据可知，宣威火腿中可产生的多肽类成分较多，相同浓度下的抗氧化活性较金华火腿更显著。因此，在后续的抗氧化肽分离纯化试验中，主要选取宣威火腿多肽为主要原料来源。 2.宣威火腿中抗氧化肽的分离、纯化与鉴定 本章主要选取宣威火腿为原料，首先提取火腿中的多肽成分，然后采用G-25凝胶色谱柱、离子交换柱、高效液相色谱等多种技术对宣威火腿多肽进行纯化。同时，以DPPH、O2-·、T-AOC活性对分离纯化后多肽的功能进行检测，从而选择具有较高抗氧化活性的片段。在经过G-25纯化后，组分C的DPPH和O2-·清除活性均高于其他组分。离子交换柱层析分离后，组分C5的抗氧化活性显著提升。通过制备型液相分离后，C5-7的峰值最高抗氧化活性相对于其他峰片段最高。最后将C5-7进行液相质谱连用分析，得到的多肽片段为Asp-Leu-Glu-Glu(DLEE)。体外合成该多肽序列，并以DPPH自由基清除活性验证合成多肽的活性，该合成序列与分离纯化后的多肽在DPPH自由基清除活性方面没有显著差异，从而说明此多肽DLEE在发挥抗氧化功能中具有主要作用。 3.细胞电化学方法对抗氧化肽DLEE的功能评价及方法应用 本章以脉冲伏安法的电化学检测为基础，通过将Caco-2细胞与改性电极相结合，构建细胞电化学平台，并借助细胞电极对DLEE的抗氧化活性进行评定。首先选取纳米铂粒子、纳米银线为电极修饰材料，同时将海藻酸钠、石墨烯、DMEM细胞培养基混合制备细胞凝胶。随后，将Caco-2细胞进行多肽孵育和H2O2氧化损伤处理;最后将DLEE孵育和氧化损伤处理的Caco-2细胞固定在电化学电极上，检测电化学氧化还原信号的强弱;由此验证DLEE在Caco-2细胞中的抗氧化效果。研究结果显示，电化学细胞传感器对Caco-2细胞中H2O2浓度检测具有良好的灵敏性。在0.2～2μM的范围内，H2O2浓度与电流值变化呈现线性关系，检测最低浓度为0.12μM。同时，将传感器应用到宣威火腿多肽DLEE的抗氧化能力检测中，检测得到在DLEE1.5mg/mL浓度时的抗氧化值为88.17％。综合以上结果可知，本试验构建的细胞传感器在检测H2O2浓度中具有较高的灵敏性，细胞传感器可应用于活性多肽的抗氧化检测中。 4.抗氧化肽DLEE的体外模拟消化及在Caco-2细胞中的跨膜吸收方式 本章选取胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟体外消化过程，用液相鉴定方法分析DLEE的消化稳定性，然后选取Caco-2细胞，构建体外肠道上皮细胞模型，探究DLEE在细胞跨膜转运中的转运方式。研究结果显示，经体外消化后的DLEE未发生酶降解，从而保持原肽链结构，培养21天的Caco-2细胞在单层极性、碱性磷酸酶活性方面均达到建模的要求，不同孵育时间、孵育浓度对DLEE的跨膜转运均有影响。在Caco-2细胞单层膜刷状缘，DLEE可以稳定存在，随着时间的延长，DLEE达到基地侧的浓度逐渐增大。最后在Caco-2细胞基顶侧添加跨膜转运抑制剂Gly-Pro、渥曼青霉素、去氧胆酸钠、叠氮化钠、细胞松弛素D，分析DLEE在穿越Caco-2细胞时的跨膜方式。通过添加不同转运方式抑制剂和促进剂并检测基底侧的DLEE浓度可知，旁路转运促进剂细胞松弛素D是影响多肽跨膜转运的主要因素，跨膜转运后的TEER值显著下降。DLEE可下调Occludin的表达而促进跨膜转运，综合以上结果可知，旁路转运是DLEE的主要跨膜转运途径。 5.抗氧化肽DLEE对Caco-2细胞的保护作用及抗氧化调控机理研究 本章以Caco-2细胞为载体，将DLEE孵育处理与H2O2氧化损伤处理相结合，探究抗氧化肽对细胞保护作用的调节机理。在抗氧化肽孵育后进行H2O2氧化损伤处理，观测细胞内活性氧(ROS)生成量与细胞总抗氧化值，然后提取细胞蛋白检测过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽转移酶(GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性，进而采用WesternBlot方法进一步分析两种抗氧化通路蛋白Nrf2与Keap1的表达差异，最后借助流失细胞术分析DLEE孵育细胞后对细胞凋亡程度的影响。研究结果显示，H2O2氧化损伤处理会诱导Caco-2细胞内ROS的增加并抑制抗氧化酶的活性，DLEE处理可缓解氧化诱导引起的ROS产生，恢复抗氧化酶活性。结合抗氧化信号通路蛋白Nrf2和Keap1的表达可知，氧化损伤会抑制Nrf2/Keap1通路，而抗氧化肽DLEE有助于缓解Nrf2蛋白的表达，进而调节抗氧化酶的活性，对Caco-2细胞应对氧化应激起保护作用。
NETL