摘要
棉花是一种重要的经济作物，是世界上重要的天然纤维和油料的来源，但是其产量以及纤维品质严重受黄萎病菌(Verticillium dahliae)危害。黄萎病菌为土传型真菌性病害，一般通过根部侵入便会逐步向地上部扩张最终危害整个棉花植株。棉花黄萎病一直无法得到根治，已经成为棉花生产上的第一大病害。发掘棉花关键抗病基因，阐明其作用机制，不仅为研究植物与病原菌互作机理提供理论参考依据，而且为创制棉花抗病种质材料提供重要的候选基因。 植物通过定位于植物细胞表面模式识别受体(PRR)识别病原体中保守的基序病程相关分子模式(PAMPs)和病原体入侵造成的植物损害损伤相关的分子模式(DAMPs)。通过PRR识别PAMP和DAMPs触发免疫称为基础免疫(PTI)，伴随着活性氧(ROS)的爆发，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活和免疫相关基因表达的变化。众所周知，类受体激酶(receptor-like kinases，RLK)是一类重要的模式识别受体(PRR)，在抗病性中起关键作用。细胞壁相关激酶家族是类受体蛋白激酶超家族中的一个亚家族。其中，细胞壁相关激酶(WAKs)已被证明是植物抗真菌型病害的正调节因子。WAK基因受多种病原菌的转录调节，但是该调节中涉及的途径是未知的。 本研究分别用抗病性较好的海岛棉Hai7124、感病材料陆地棉军棉1号和陆地棉遗传标准系TM-1，以及黄萎病菌生理型V991为实验材料，利用已释放的棉花的基因组数据，对棉花细胞壁相关激酶和类细胞壁相关激酶基因家族进行全基因组挖掘、分类及抗病功能探究。主要研究结果如下: 1.棉花细胞壁相关激酶基因(WAK)的挖掘与抗病性分析。分别在二倍体雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)，四倍体陆地棉遗传标准系TM-1(AD1)和海岛棉3-79(AD2)中对棉花细胞壁相关激酶进行全基因组鉴定和抗病功能分析。最终在雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉3-79中分别鉴定出50、39、81和85个WAK基因。以雷蒙德氏棉为例，按照进化分析和蛋白结构特点把雷蒙德氏棉中50个WAK基因分成两大类。为了进一步探究WAK基因的功能，分别在陆地棉遗传标准系TM-1的不同组织和器官以及黄萎病菌诱导下海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1根组织中，分析WAK基因的表达特征。结果发现WAK15、WAK33和WAK49极显著受到黄萎病菌的诱导且相对表达水平较高，在根和叶中优势表达。利用VIGS技术沉默这三个候选基因，发现WAK33基因沉默后发病率显著提高，但另外两个基因与TRV:00发病率无显著变化。WAK33蛋白定位于细胞膜与核上，VIGS沉默WAK33后，抑制了SA的产生及病程相关基因的表达从而降低棉花对黄萎病的抗性。 2.棉花中类细胞壁相关激酶基因(WAKL)的挖掘与抗病性鉴定。利用已公布的四个测序棉种的基因组数据信息，分别在雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉TM-1和海岛棉3-79中鉴定了65，40，81和86个WAKL基因家族成员。对雷蒙德氏棉中65个WAKL基因进行系统进化分类分析表明这些WAKL可以分成3大类，且各自具有可明显区分的蛋白结构特征。通过WAKL在陆地棉TM-1中不同组织器官表达模式分析发现这类基因主要在根茎叶中优势表达。利用黄萎病诱导的海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1根的转录组数据分析，进一步确定与黄萎病抗性相关的WAKL候选基因WAKL47。经过qRT-PCR验证WAKL47确实受黄萎病诱导且在根和叶中具有较高的表达水平。通过VIGS技术沉默WAKL47基因棉花感病性显著上升，表明WAKL47基因在棉花与黄萎病菌互作中发挥重要作用。
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