摘要
猪肉是我国大部分地区的动物性蛋白主要来源，随着人们生活水平的提高，猪肉品质成为广大消费者关注的热点，猪肉品质的改善也因此成为我国养猪领域亟需解决的课题。猪肉品质评定的主要指标包括肉色、pH、系水力、肌内脂肪以及嫩度等，其中肉色这项指标最为直观，肉色的好坏直接影响消费者的购买欲望。猪肉色性状的遗传改良一直以来是猪遗传育种领域关注的热点，常规育种手段对猪肉色性状的改良成果并不理想。因此，筛选影响猪肉色性状的关键基因，鉴定有价值的分子标记，对于加快猪肉色性状的遗传改良以及猪肉品质的提高具有重要意义。本研究采用高通量测序技术对猪不同肉色的骨骼肌进行全基因组转录组测序，在差异表达基因筛选基础上，发现猪Prox1基因(ENSSSCG00000015584)在红肌中的表达水平极显著高于白肌(log2Fold=1.53，q-value=0.0001)，是一个潜在的影响猪肉质性状的候选基因。先前的研究表明，Prox1是一个影响骨骼肌生长发育的重要转录因子。目前关于猪Prox1的研究在国内外尚未见报道，其是否会影响猪肉质性状仍不清楚。本研究利用高通量测序技术筛选出了一系列影响猪肉色性状的候选基因，并重点研究了猪肉色性状候选基因Prox1的生物学特点，包括基因mRNA序列特征、表达模式、启动子活性，以及启动子区变异位点多态性与相关SNPs多态性与猪肉质性状的关系，本研究结果为后续猪肉质性状的遗传改良奠定了重要的理论基础。本研究的主要研究内容及结果如下: 1.转录组测序筛选影响猪肉色性状的候选基因 本研究利用3头全同胞杜洛克×梅山二元母猪的比目鱼肌(Sol，红肌)、股二头肌(Bf,白肌)构建了6个cDNA文库，包括Bf28，Bf35，Bf36，Sol28，Sol35和Sol36，利用高通量转录组测序技术进行了差异基因筛选。根据个体内两种肌肉两两比对的策略，从Bf28vsSol28，Bf35vsSol35，Bf36vsSol36比较组中分别筛选出770，810以及476个差异表达基因;根据两种肌肉的3个数据库混和比对的方法，共筛选出138个差异表达基因。综合两种方法，共筛选出了52个重叠的差异表达基因。在此基础上，利用上述所筛选出的差异表达基因进行GO富集分析、KEGG代谢通路分析。最后，通过对差异表达基因在猪数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)数据库的比对，共筛选出114个非冗余差异表达基因定位于肉色性状相关的QTLs中。 2.猪Prox1基因的克隆及表达模式分析 本研究以7日龄二花脸仔猪作为试验材料，取腿部骨骼肌组织用于总RNA提取并反转成cDNA。根据NCBI上预测的猪Prox1mRNA序列设计5'RACE，3'RACE引物，根据预测的mRNA设计了3对扩增编码区的引物。测序结果发现，Prxo1基因存在两个转录本，第一种转录本全长3683bp，包含484bp5'非翻译区序列，2214bp的编码序列以及985bp的3'非翻译区序列。第二种转录本全长4236bp，包括1037bp5'非翻译区序列，2214bp编码序列以及985bp的3'非翻译区序列。利用Real-timePCR技术对Prox1基因在杜洛克×梅山二元杂交成年猪、70日长白胎儿猪不同组织，以及长白猪不同发育阶段的表达模式进行了分析。研究结果显著，Prox1基因在肝、心脏组织高表达，而在肺、脾、肾、胃以及脂肪组织中低表达。在骨骼肌肉中表达模式中发现，Prox1基因在比目鱼肌(红肌)的表达量显著高于股二头肌(白肌)(P＜0.01)。不同发育时期的表达模式表明，Prox1基因在出生前的表达量高于出生后。此外，本研究利用皮×杜×长×大四元商品猪群体背最长肌样，对Prox1与3种肌球蛋白重链(MyHCⅠ、MyHCⅡB以及MyHCⅡX)、Myoglobin的表达模式进行了比较分析。分析结果发现，Prox1基因在高低肉色组的表达规律与MyHCⅠ、Myoglobin一致;与MyHCⅡB的表达模式却相反。 3.猪Prox1基因核心启动子区鉴定 本研究将Prox1基因两个转录本的两种不同启动子区的各5个不同片段插入pGL3.0-Basic载体，两个转录本的启动子分别构建个5双荧光素酶报告载体。第一个转录本的启动子片段缺失载体分别命名为pGL3.0-Basic-P11(+122/+318)、pGL3.0-Basic-P12(-192/+318)、pGL3.0-Basic-P13(-682/+318)、pGL3.0-Basic-P14(-1182/+318)、pGL3.0-Basic-P15(-1957/+318);第二个转录本的启动子片段缺失载体分别命名为pGL3.0-Basic-P21(-146/+117)、pGL3.0-Basic-P22(-458/+117)、pGL3.0-Basic-P23(-1080/+117)、pGL3.0-Basic-P24(-1584/+117)、pGL3.0-Basic-P25(-2178/+117)。将上述10个载体分别转染293T细胞、PK15细胞中，最后进行双荧光素酶活性分析。第一个启动子区不同片段荧光素酶活性分析发现:在293T细胞中，+122/+318荧光活性最强，而在-192/+318、-682/+318、-1182/+318这四个片段荧光活性逐渐减弱，可能存在负调控元件。-1182/-1957bp区域的荧光活性增强，这片段可能存在正调控元件。在PK15细胞中，片段荧光素酶活性与293T细胞存在差异。-192/+318、-1182/+318这两个片段的荧光素酶活性最高，对应的区域可能存在正调控元件。而+122/+318、-682/+318、-1957/+318这三个片段的双荧光素酶活性较弱。第二个启动区不同片段的双荧光素酶活性分析发现:在pGL3.0-Basic-P21(-146/+117)片段荧光活性在两种细胞中活性都是最高的，表明该区域为第二个启动子的核心区域。 4.猪Prox1基因启动子区变异位点多态性与猪肉质性状的关联分析 本研究利用靶向测序方法，对200头试验猪，包括66头皮×杜×长×大四元猪、22头长白猪、22头大白猪、9头杜洛克猪、21头二花脸、20头梅山、20头米猪，以及20头苏淮猪Prox1基因第一个转录本启动子区2kb区域进行靶向测序。测序结果共鉴定出18个变异位点，并对18个变异位点在不同猪种的遗传多样性进行了分析。分析结果发现其中8个变异位点在不同猪种存在广泛的多态性。在此基础上，利用PCR-RFLP分型方法对其中三个SNPs，SNV11(g.-930 bp)、SNV14(g.-1421 bp)、SNV18(g.-1421 bp)在279头皮×杜×长×大四元商品猪进行基因分型，并利用SAS软件对这些位点的多态性与11个表型性状进行了关联性分析。基因分型结果显示，三位处于紧密连锁。而关联分析结果显示，三位点的多态性与pH24h表型呈显著相关(P=0.022)，与24h滴水损失相关性接近显著水平(P=0.07)。 综上所述，猪Prox1基因是一个影响猪肉品质的重要候选基因。这些研究结果为利用Prox1基因开展猪肉品质性状的遗传改良提供了理论依据。
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