摘要
南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是危害农业生产的一种重要的植物寄生线虫，在侵染寄生过程中线虫会分泌效应蛋白来调控植物免疫并促进寄生，其中，类毒液过敏原蛋白(venom allergen-like protein，VAP)家族就是其中一类重要的效应蛋白。本文以南方根结线虫效应蛋白MiV98为研究对象，对MiV98抑制植物免疫反应以及与番茄半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim互作进行了研究，主要结果如下: 1.南方根结线虫效应蛋白MiV98序列分析及表达模式 利用设计的特异性引物从南方根结线虫cDNA中克隆了MiV98基因，其编码区序列(CDS)长735bp，含有21个氨基酸的分泌信号肽，MiV98蛋白等电点为7.28，二级结构预测显示含有8个α螺旋5个β折叠，功能域预测显示含有SCP保守结构域，含有4个糖基化位点、18个磷酸化位点。基于VAP氨基酸序列构建的系统进化树显示，MiV98与禾谷孢囊线虫的HaVAP2亲缘关系较近。原位杂交显示MiV98基因的表达定位于南方根结线虫的亚腹食道腺细胞，qRT-PCR检测显示MiV98基因在南方根结线虫4龄幼虫期的表达量最高，推测MiV98是一种由南方根结线虫亚腹食道腺细胞分泌且在线虫寄生后期发挥作用的效应蛋白。 2.MiV98蛋白对南方根结线虫寄生及植物免疫的影响 利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术对MiV98基因进行活体沉默后，qRT-PCR检测TRV∷MiV98农杆菌处理番茄株系的线虫MiV98基因表达水平，相比野生型对照番茄降低了约65％;雌虫的数量下降了约20％，雌虫产卵量也减少约22％;利用农杆菌介导法在本氏烟叶片上瞬时表达MiV98蛋白，带信号肽的MiV98能够特异性的抑制激发子R3a/Avr3a引发的PCD反应，也能够抑制flg22激发的PR相关基因PR1、PR2、PR3、PR5和Pti5的表达，并且能够显著地促进辣椒疫霉菌对烟草叶片的侵染。 3.MiV98蛋白与番茄半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim互作验证及Cf-2/Rcr3pim番茄品系对南方根结线虫的抗性测定 利用酵母双杂(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和GSTpull-down技术验证南方根结线虫MiV98蛋白与番茄质外体半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim及其功能域Rcr3pimcd的互作，结果显示MiV98在酵母和烟草系统中均能与Rcr3pim及Rcr3pimcd发生互作，MiV98不能与Rcr3pim发生体外互作，但能与Rcr3pimcd发生微弱体外互作。此外，测定了Cf-2/Rcr3pim番茄品系对南方根结线虫的抗性，评价结果显示，Cf-0/Rcr3pim品系对南方根结线虫表现高感，Cf-2/Rcr3-3品系为中度感病，而Cf-2/Rcr3pim品系则为感病。与Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3基因型相比，Cf-2/Rcr3pim基因型番茄品系虽然对南方根结线虫侵染的敏感性略低，但是不能阻止线虫在根系上的大量繁殖，不适于根结线虫的防控应用。 总之，由南方根结线虫亚腹食道腺细胞分泌的MiV98蛋白在线虫寄生后期发挥作用，能够抑制植物细胞的PTI和ETI反应，促进辣椒疫霉菌和线虫的侵染;MiV98蛋白可以与番茄质外体半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim及其功能域Rcr3pimcd发生互作，并且Cf-2/Rcr3pim能够激发植物体内的防卫反应来阻止南方根结线虫的侵染。
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