摘要
糖分含量是评价梨果实品质的重要的指标之一，糖的分解代谢有多种途径，其中磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase)在糖酵解代谢过程中起着重要作用。植物具有两种类型的磷酸果糖激酶蛋白用于磷酸化果糖-6-磷酸，分别是依赖于焦磷酸盐(PPi)的果糖-6-磷酸磷酸转移酶(pyrophosphate phosphofructokinase，PFP)和依赖于ATP的磷酸果糖激酶(ATP-dependent phosphofructokinase，PFK)。但是目前，磷酸果糖激酶基因家族在梨中的基因进化、表达模式和基因功能还未知，有待于挖掘。近年来，随着基因编辑技术的建立和不断完善，在植物遗传改良上展现出广阔的应用前景，但是由于梨受遗传转化体系的限制，尚未有利用基因编辑技术开展遗传改良的成功实例。为此，本研究以梨为试材，开展了磷酸果糖激酶基因家族的分析和功能基因筛选，同时，构建了梨的基因编辑表达载体，初步探索了基因编辑技术体系，具体结果如下: 1.利用梨等5个蔷薇科果树物种的全基因组序列，对磷酸果糖激酶基因家族进行鉴定，并应用生物信息学方法分析其进化关系、染色体定位和复制模式等。结果表明，梨、苹果、桃、草莓、梅的磷酸果糖激酶基因家族成员分别有14个、17个、9个、8个和7个。系统进化分析表明，梨中磷酸果糖激酶基因家族可分为2个亚家族，其中10个基因属于PbPFK亚家族，4个基因属于PbPFP亚家族。进化分析表明，在梨等蔷薇科物种中，全基因组复制、片段复制和分散复制为磷酸果糖激酶基因扩张的主要模式;同时，发现了磷酸果糖激酶的保守序列和外显子数，支撑了其功能的保守性。通过对梨中磷酸果糖激酶基因的顺式调控元件序列分析，确定了其基因启动子的光调控和MYB结合位点，表明磷酸果糖激酶可能受光和MYB转录因子(transcription factor，TFs)调控。 2.研究梨中磷酸果糖激酶基因家族在‘砀山酥梨’不同组织及不同发育时期的表达模式，实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)分析表明，梨中PbPFP1的表达模式与山梨醇含量变化趋势相似。进一步的功能分析表明，PbPFP1定位于细胞膜上，在梨果实中PbPFP1的瞬时过表达导致了果糖和山梨醇含量的显著上升，表明其在梨果实发育过程中对糖分积累有重要贡献。 3.研究以野生秋子梨组培苗为材料，在优化遗传转化体系的基础上，以梨的八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase，PbPDS)基因作为靶标，分别构建了梨的CRISPR/Cas9和CRISPR-Cpf1基因编辑技术体系。采用Gateway体系构建了双靶点的JH4-JH19载体，也用传统酶切方法构建了双靶点载体pHSE401。对以上载体及CRISPR-Cpf1系统的PS59载体采用农杆菌转化法侵染秋子梨叶片，其中载体PS59侵染的再生植株出现局域芽白化现象。研究结果为进一步熟化梨的基因编辑技术体系和遗传改良应用奠定了基础。
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