摘要
小麦作为我国最重要的粮食作物之一，其安全生产至关重要。由假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病是一种世界性的土传病害，尤其是在我国黄淮麦区呈现迅速蔓延和逐年加重的趋势，而且生产上缺乏有效的抗病小麦品种，导致病害防治困难。前期对假禾谷镰孢的发生分布、遗传多样性和致病性分化等方面进行了系统研究，但是对其生长、发育和致病的分子机理研究较少。遗传转化是从分子水平解析真菌致病过程调控机理的主要策略，常用的包括农杆菌介导的和PEG介导的遗传转化。本研究建立了PEG介导的假禾谷镰孢原生质体遗传转化，并以转录因子为靶标，完善了PEG介导的假禾谷镰孢基因缺失和回补技术，分析了多个转录因子在假禾谷镰孢生长、产孢和侵染过程中的功能，获得的主要结果包括: 利用PEG介导的遗传转化分析APSES类转录因子在假禾谷镰孢中的生物学功能。根据物种中已知的APSES类转录因子，在假禾谷镰孢中鉴定到4个APSES同源蛋白，均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树，发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES，FpAPSES3(FpStuA)分布在C组。表达分析发现FpAPSESs均在侵染阶段诱导表达，其中FpStuA在假禾谷镰孢中的表达量最高。选择FpStuA、FpAPSES1和FpAPSES4做进一步功能分析，通过PEG介导的遗传转化方法分别获得其缺失突变体。表型分析发现，与假禾谷镰孢野生型菌株相比，△fpstua、△fpapses1和△fpapses4突变体的生长速度明显减慢、气生菌丝减少，分生孢子的产生显著下降且分生孢子变短、分隔减少，致病性显著降低，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少，△fpapses1和△fpapses4在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展受阻。以上结果说明，编码APSES同源蛋白的FpStuA、FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病性均具有非常重要的作用。表型分析发现，PEG介导的遗传转化获得的同基因缺失转化子间表型一致，但是利用PEG介导的遗传转化没有获得APSES转录因子的回补转化子。 利用PEG介导的遗传转化分析C2H2锌指转录因子FpCzf14在假禾谷镰孢中的生物学功能。C2H2锌指转录因子数量多，在真菌生长和产孢过程中具有广泛的调控作用。在假禾谷镰孢中克隆了一个编码C2H2锌指转录因子的基因FpCzf14。FpCzf14在分生孢子中的表达显著上调，猜测FpCzf14可能参与假禾谷镰孢分生孢子的产生。通过PEG介导的遗传转化获得了FpCzf14基因缺失的突变体和回补菌株。FpCzf14主要定位在细胞核。分析发现，与野生型和回补菌株相比，△fpczf14突变体的菌丝生长减慢，不能产生分生孢子，对小麦胚芽鞘、大麦叶片和小麦根的致病性均显著降低，在宿主组织内的侵入性菌丝减少。此外，qRT-PCR分析发现，△fpczf14突变体中产孢相关的基因的表达明显降低。说明FpCzf14对假禾谷镰孢分生孢子的产生非常关键。 利用PEG介导的遗传转化分析bZIP转录因子Fpkapc在假禾谷镰孢中的生物学功能。碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族的转录因子广泛分布于真核生物中，调控生长、发育和抗逆等多种生物学过程。在假禾谷镰孢中鉴定到一个编码bZIP类转录因子的Fpkapc基因。通过PEG介导的遗传转化，获得Fpkapc基因缺失突变体和回补菌株。Fpkapc定位于细胞核。分析结果显示，与假禾谷镰孢野生型和回补菌株相比，△fpkapc突变体菌丝生长减慢，分生孢子产生减少、孢子变短，但是分生孢子萌发速度加快，在大麦叶片和小麦根部的致病性降低，而在小麦胚芽鞘上产生较长病斑，但是小麦表皮细胞内的菌丝减少。说明Fpkapc作用于假禾谷镰孢的生长、产孢和致病力。 本研究利用PEG介导的遗传转化技术解析了多个转录因子在假禾谷镰孢生长、发育和致病中的作用，为探索假禾谷镰孢致病过程的分子机理提供了技术和理论支撑。
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