摘要
蛋鸡的产蛋性能与卵泡发育密切相关，卵泡发育的全过程都伴随着颗粒细胞的生长。卵巢颗粒细胞在调节蛋鸡卵泡发育、成熟和闭锁等过程中有重要作用。因此，为了探讨褪黑素-卵巢颗粒细胞-产蛋性能的关系，本研究采取体外和体内试验相结合的方法，探讨了褪黑素对鸡卵巢颗粒细胞的抗氧化性能、抗凋亡性能的影响。主要结果如下: 1.鸡卵巢颗粒细胞的培养与鉴定。结果显示:在M199基础培养基+1％ITS+1％双抗的培养体系中鸡卵巢颗粒细胞呈梭形或者多角形且生长状态良好;PCR鉴定特异性FSHR基因显示，191bp处出现预期基因条带，经测序验证，此细胞为鸡卵巢颗粒细胞;免疫荧光结果显示，特异性FSHR蛋白在胞浆分布，与DAP1染色相比可知，FSHR阳性率在98％以上，故所培养颗粒细胞纯度＞98％。鸡卵巢颗粒细胞生长曲线结果显示，细胞对数生长期为18～72h。 2.褪黑素对鸡卵巢颗粒细胞的影响:(1)使用荧光定量PCR测定褪黑素对卵巢颗粒细胞MT1、MT2、FSHR和LHRmRNA相对表达水平的影响，ELISA试剂盒检测第二信使cAMP和E2的变化量。结果显示:1ng/mL褪黑素处理组MT1、MT2和LHRmRNA相对表达和E2分泌量显著增加(p＜0.05);5ng/mL褪黑素处理组cAMP显著减少13.16％(p＜0.05)，抑制FSHRmRNA相对表达3倍左右(p＜0.05)。(2)使用ELISA试剂盒测定褪黑素对鸡卵巢颗粒细胞ROS、T-AOC和SOD的影响。结果显示:1ng/mL褪黑素处理组ROS积累显著减少18.67％(p＜0.05)，T-AOC提高71％且差异显著(p＜0.05);0.1ng/mL褪黑素处理组SOD活性提高40.46％(p＜0.05)。(3)使用CCK-8试剂盒检测鸡卵巢颗粒细胞生长状况，荧光定量PCR测定抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3mRNA表达水平。结果显示:1ng/mL褪黑素处理鸡卵巢颗粒细胞，OD450nm最高，细胞生长良好;1ng/mL褪黑素处理组，BaxmRNA表达显著降低5倍(p＜0.05)，Bcl-2mRNA表达显著升高了3倍左右(p＜0.05)，0.1ng/mL褪黑素处理24h，Caspase-3mRNA表达也显著上调了2倍左右(p＜0.05)。 3.动物试验:选取产蛋末期(550日龄)的蛋鸡分成两组(对照组和试验组)，试验组每1kg饲料中添加1mg褪黑素，饲喂4周。结果显示:与饲喂前相比，对照组产蛋率下降1.62％，差异显著(p＜0.05)，试验组产蛋率增加0.54％，差异不显著(p＞0.05);对照组破蛋率上升1.59％，差异显著(p＜0.05)，试验组破蛋率下降0.26％，差异不显著(p＞0.05)。 本研究结果表明，褪黑素通过作用于受体MT1和MT2，影响激素FSH和LH的分泌及其受体的表达，刺激雌激素分泌，进而提高颗粒细胞发育质量，促进卵泡发育。褪黑素还可以通过其抗氧化能力，降低ROS水平，提高抗氧化酶活性，减少氧化应激对卵泡发育的刺激，改善卵泡发育环境，促进卵泡向下一级发育。褪黑素通过抑制促凋亡因子Bax、Caspase-3和刺激抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达，起到促进颗粒细胞增殖的作用，进而抑制卵泡闭锁。在体试验表明外源性褪黑素可以维持甚至增加产蛋末期蛋鸡产蛋率。本研究为利用褪黑素延缓卵巢衰老，提高蛋鸡生产性能提供依据。
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