摘要
L-苹果酸是生物体TCA循环中的一种中间产物，在食品医药和化工等行业具有很高的应用价值。目前工业上主要有三种方法生产L-苹果酸，分别是化学合成法、固定化法(酶转化法)和微生物发酵法。随着人们对工业生产环境的要求日益提高，化学合成法和固定化法原料成本不断上升以及L-苹果酸在食品行业应用越来越广泛，微生物发酵法成为了未来最有发展前景的L-苹果酸生产方法，同时也是人们研究的热点。 为了获得高产L-苹果酸的菌株，本文通过代谢工程对野生型E.coliMG1655进行了基因组层面的改造，通过好氧发酵使苹果酸产率达到理论产率的66％。改造主要分为三个部分: (1)首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了E.coliMG1655的poxB、pta-ackA、ldhA、pflB基因，阻断丙酮酸的副产物代谢途径，增大TCA循环的通量，得到了工程菌株M04。发酵培养后丙酮酸产量达到5.68g/L，L-苹果酸产量达到了4.09g/L。 (2)然后在菌株M04基础上敲除了苹果酸酶基因maeA和maeB，防止L-苹果酸回补流向丙酮酸，得到了菌株M06。与菌株M04相比丙酮酸产量下降了1.98g/L，L-苹果酸产量增加了4.21g/L。证明丙酮酸回补途径的敲除使得代谢通量更多的流向了L-苹果酸。 (3)最后在菌株M06基础上继续敲除了pfkA基因，通过阻断糖酵解途径使葡萄糖更多的通过磷酸戊糖途径代谢，从而产生更多的NADPH，增大胞内的还原力，最后获得突变菌株M07。经过摇瓶发酵48h后，菌株M07的L-苹果酸产量达到9.893g/L，得率为0.66mol/mol苹果酸/葡萄糖。 与野生型相比，菌株M07生长速率和葡萄糖消耗有所下降，但是L-苹果酸积累量提高了9.081g/L，同时副产物乳酸和乙酸分别下降了94％和77％，这对于获取较高纯度的苹果酸是有利的。
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