摘要
扩展多能干细胞（extendedpluripotentstemcells,EPSCs）是一种新型的多能干细胞，已经在小鼠、人和猪中获得，并可以通过形成嵌合体的方式分化为胚胎和胚外组织。但牛的EPSCs能否生成及其嵌合能力仍不清楚。本研究利用LCDM培养体系，将牛的诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSCs）转化为EPSCs，并检测这种细胞的多能性和异种嵌合能力。结果显示，EPSCs在LCDM培养液中，保持紧密的克隆状态，且碱性磷酸酶呈阳性。QPCR检测显示，与iPSCs相比，初始态（Na?ve）多能基因OCT4、NANOG、REX1、FGF4、KLF5和始发态（Primed）标记基因DNMT3B在EPSCs上调，而TBX3和MEIS1下调。免疫荧光染色显示，EPSCs表达OCT4、SOX2和NANOG，其中一部分细胞表达2-细胞期胚胎相关蛋白DPPA2和DPPA4。体外分化实验证明牛EPSCs具备分化为三胚层的能力。在嵌合能力的检测中，发现单个细胞即可嵌合到早期胚胎的内细胞团和滋养层，多细胞注射不仅可以嵌合到内细胞团和滋养层，还可嵌合到E6.5胚胎的胚胎外胚层和脏壁内胚层，E9.5的胎盘、卵黄囊和胎儿，以及E13.5的胎盘、卵黄囊和胎儿的多种组织。以上结果说明，LCDM培养体系支持牛EPSCs的建立。 TFAP2C基因在人和小鼠原始生殖细胞（primordialgermcells,PGCs）形成过程的复杂调控网络中，起着承上启下的重要作用，作为报告基因广泛地用于筛选人和小鼠的PGCs。为了获得用来特异性筛选牛PGCs的报告系统，依据牛的Rosa26基因序列设计了一段sgRNA，引导CRISPR/Cas9蛋白的发挥其切割作用。并将sgRNA连接到CRISPR/Cas9载体上。在切割位点上下游各选择1kb左右同源臂，利用PCR扩增后，与牛TFAP2C启动子区域分别连接到pKlrkt载体上，并命名为pGTlrkt。将CRISPR/Cas9和打靶载体同时转染牛EPSCs，经G418筛选，共获得29个单克隆细胞系，长片段PCR检测结果显示未获得打靶成功细胞系。为了探究TFAP2C过表达对牛EPSCs形成PGCs的影响，我们扩增了其cDNA，并连接到PiggyBac转座子载体。将这个载体转入EPSCs后，TFAP2C基因的表达水平显著提高，而多能性基因和生殖谱系相关基因均出现不同程度的降低。 综上所述，本研究发现，LCDM培养液有助于牛EPSCs的建立，并能维持其多能性，牛EPSCs在小鼠胚胎有较强的嵌合能力。同时设计并构建了pGTlrkt-TFAP2C打靶载体和TFAP2C过表达载体，并获得了TFAP2C过表达的细胞系，为牛EPSCs基因编辑和向生殖细胞分化研究奠定了基础。
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