摘要
获得性免疫缺陷综合征（AcquiredImmunodeficiencySyndrome,AIDS）又称艾滋病，是严重威胁人类公共健康的传染病之一。这种疾病由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus,HIV）感染所引发。目前已有的治疗方案虽然可以有效地延长患者寿命，但由于无法完全清除HIV-1感染者体内的病毒潜伏库而不能彻底治愈艾滋病，治疗还会对患者产生一定的副作用并且由治疗引发的耐药性问题也亟待解决。因此，研发出有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病传播的重要干预手段。广谱中和抗体（Broadlyneutralizingantibodies,bnAbs）是人体经过长期感染HIV而逐渐产生的体液免疫应答，这是一类对大部分HIV-1流行株均具有较强中和能力的抗体，为HIV的治疗和预防策略提供了新的方向。因此能否诱导机体产生bnAbs也成为衡量一个疫苗有效性的重要标准。然而在HIV-1感染的人群中只有约20%患者体内能够产生这类bnAbs，并且通过对bnAbs在人体中进化过程的研究可以发现，这类抗体要经历2-4年的成熟进化才能够形成。人猴嵌合免疫缺陷病毒（Simian/humanimmunodeficiencyvirus,SHIV）感染的非人灵长类动物模型（Non-humanprimate,NHP）作为唯一可以用来评价HIV-1疫苗有效性的动物模型，但其能否和人类一样具有产生bnAbs的能力，且产生机制是否相同目前还不清楚。因此，建立合理的SHIV-NHP模型研究其体内bnAbs的产生及进化机制对于未来HIV-1疫苗的评价具有十分重要的意义。 在先前的研究中，很少在SHIV感染的NHP体内检测到广谱中和抗体的产生，但在几项关于SHIV-NHP模型的报道中，极个别的恒河猴在感染SHIV后血浆中产生了具有交叉活性的中和抗体，但并未分离到单克隆bnAbs。这很大程度上是由于bnAbs的产生通常需要2-4年时间，而一般的猴体实验项目所持续的时间不超过2年，抗体没有足够的时间进化成熟为bnAbs。正是由于缺少合适的长期感染模型，因此目前还无法对恒河猴体内产生的中和抗体的性质及成熟过程进行细致深入的研究。因此在本篇论文的研究中，我们利用两种SHIVs分别建立感染模型，并持续跟踪6-7年。通过长期的SHIV感染在恒河猴体内诱导产生广谱中和活性，利用不同敏感度的HIV-1流行株对血浆中和活性进行分析，并分析血浆中和抗体的作用表位。在确定产生广谱中和活性的恒河猴体内分离出单克隆bnAb，评价其中和广谱性，强度以及表位等特性。再通过分析猴体单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAbs）的谱系以及猴体内病毒包膜蛋白的突变情况追溯bnAb的进化过程以及与SHIV共同进化的过程，从而分析NHP体内与人体内产生广谱中和抗体的相关性，为更好地应用恒河猴模型来评价HIV-1疫苗提供理论和实验依据。 首先我们选择了两种感染力较强的SHIVs（SHIV1157ipd3N4和SHIVSF162P3）通过高剂量静脉单次或者低剂量直肠多次的方式感染中国恒河猴，最终在31只恒河猴体内成功建立了感染。通过对猴体内病毒载量的检测可以发现，急性感染期猴体内的病毒载量很高，进入慢性感染期后猴体内有持续的病毒存在。我们对2只SHIV1157ipd3N4感染的恒河猴（G1015R和G1020R）持续监测至感染后6年，发现在感染后期病毒载量有持续升高的趋势，这为bnAbs的产生提供了持续的抗原刺激。随后我们对保留有不同纵向时间点血浆样本的6只恒河猴的进行了中和活性的评价，发现感染早期中和抗体的交叉活性很低，随着感染时间的延长，中和广谱度逐渐升高，感染超过6年的G1015R和G1020R可以中和超过65%的tier2病毒。并且通过对比不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体的广谱度发现，SHIV1157ipd3N4诱导产生广谱中和活性的能力要强于SHIVSF162P3和SHIVCHN19P4，且直肠攻毒途径更易诱导bnAbs。中和表位特异性分析表明，V2，V3或CD4bs区域中已知bnAbs的抗性突变会降低G1015R和G1020R血浆中和抗体对病毒的敏感性，说明G1015R和G1020R产生的中和活性针对Env的V2，V3以及CD4bs区，这和人体产生的bnAbs具有相似的性质。 为了进一步分析恒河猴体内产生的bnAbs，我们通过流式细胞术对猴体内的单克隆抗体进行分离。我们选择了G1015R感染后350周的外周血淋巴细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）样品，分选了针对V2区表位特异性的单个记忆B细胞，并进行抗体可变区基因的扩增，共获得了44对重轻链配对的IgG基因，通过ELISA筛选其中对同源病毒具有结合活性的抗体，再经过大量表达纯化后进行中和抗体广谱度和强度的评价。我们共分离到12个具有中和活性的抗体，其中6个抗体具有中和多种tier2病毒的能力。J038是其中中和能力最强的mAb，可以中和54%的208个全球流行株，这也是目前报道的分离自SHIV感染的NHP体内广谱度最高的抗体。通过对抗体谱系进行分析可以发现6个具有交叉中和活性的抗体均来源于相同谱系(VH4-2*01F/VK1-20*01F)。对J038谱系抗体的识别表位进行分析，发现其识别Env主要依赖于N156位和N160聚糖以及V2环上的氨基酸残基。通过对J038Fab-C1080Env共结晶的晶体结构进行结合位点分析，可以发现J038所具备的18个氨基酸的HCDR3区并未插入EnvV2顶端的内部，而是和V2环反向平行形成了氢键。但J038和聚糖的相互作用占据了抗体-抗原近一半的结合界面，这和分离自人体的V2特异性bnAbs的特征一致。 随后，我们对J038谱系抗体的进化过程进行了追溯。通过进化树分析我们推测了J038谱系的共同祖先（Unmutatedcommonancestor,UCA）和各阶段的中间过渡抗体（Intermediatesantibodies,IAs），UCA和早期的IAs可以中和自体病毒但并不能中和异源病毒，表明J038谱系的广谱中和能力是通过感染过程中逐渐积累突变进化获得的。对各阶段过渡体的结合位点进行同源建模分析可以发现J038谱系抗体在进化的过程中逐渐积累了对包膜蛋白V2区N156和N160位聚糖的结合界面也验证了J038谱系广谱中和抗体的进化过程。通过比对G1015R各时期血浆中病毒env序列可以发现，J038谱系所识别的V2区已经逐渐积累了稳定的突变，其中I165L，K171R和V172A会造成病毒对J038谱系抗体的中和敏感度下降，表明在G1015R恒河猴体内病毒由于中和抗体的选择压力已经产生了逃逸突变。尽管在猴体内抗体选择压力下所产生的逃逸突变和人体内所检测到的突变不完全相同，但猴体内bnAbs和人体内bnAbs的进化过程具有很多相似之处。 综上所述，本文成功建立了最长时间的SHIV-NHP感染模型，在其体内诱导产生了广谱中和活性，通过分离单克隆bnAbs获得了目前分离自SHIV感染恒河猴体内中和广谱度最高的的J038谱系抗体，通过对NHP体内产生的bnAbs的性质和进化过程进行了深入的研究发现J038识别与人源V2特异性广谱中和抗体相同的表位，在进化过程中通过积累对聚糖的结合增强广谱性。并且J038谱系的产生也对猴体的病毒产生了免疫选择压力且病毒在此压力下也积累了逃逸突变。通过这项研究对NHP体内是否能产生和人体类似bnAbs及其产生机制进行了合理的分析和阐释。通过本篇论文的研究，可以为更好地应用SHIV-NHP模型评价HIV-1疫苗提供一定的理论和实验依据。
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