摘要
昆虫进化出各种躯体模式来适应外界环境，其中一个重要的特征就是附肢的进化。附肢是昆虫身体结构的重要组成部分，形态多样的附肢使它们有更好的优势进行取食和生存。Hox基因家族的Antp、Ubx和Abd-B基因在昆虫附肢的形成过程中发挥着重要的作用，当前这3个基因在草地贪夜蛾中的具体功能研究尚未报道。因此我们选择Abd-B、Antp和Ubx3个基因作为研究的靶标，通过CRISPR/Cas9基因敲除技术初步探究它们在草地贪夜蛾中的生物学功能。具体研究内容如下: (1)SfAntp、SfUbx和SfAbd-B基因的生物信息学分析: SfAntp、SfUbx和SfAbd-B基因的开放阅读框序列全长分别为912bp、765bp和963bp，编码的氨基酸残基数分别为303、254和320，它们都包含2个外显子和1个内含子。根据氨基酸同源性分析和系统发育进化树可得，Antp、Ubx和Abd-B在鳞翅目昆虫中的同源性都很高，均达到90％以上，且草地贪夜蛾的Antp、Ubx和Abd-B基因都与斜纹夜蛾的亲缘关系最近。 (2)SfAntp、SfUbx和SfAbd-B的表达模式分析: 通过QRT-PCR检测SfAntp、SfUbx、SfAbd-B的表达谱，结果显示这3个基因在草地贪夜蛾整个生命周期均有表达。在胚胎发育时期，SfAntp在胚胎发育至6h时表达量最低，从发育至12h开始一直到48h均有较高的表达量;SfUbx在胚胎发育初期表达量较低，随着发育的进行表达量逐渐上升，而到胚胎发育后期表达量降低，整体呈先上升后下降的趋势。SfAbd-B的表达模式与SfUbx相似，即在胚胎发育中期表达水平最高。在卵到成虫的不同发育时期，SfAntp、SfUbx和SfAbd-B均在卵期的表达量最高。通过检测成虫的头、胸节、腹节、外生殖器、触角、翅和足7个组织中3个基因的表达量，结果显示SfAntp在成虫胸节和足中的表达量最高，SfUbx在翅和足中表达量最高，SfAbd-B在生殖节中表达量最高。 (3)SfAntp、SfUbx和SfAbd-B的基因敲除: 分别在SfAntp、SfUbx和SffAbd-B的第一个外显子上设计sgRNA位点通过显微注射对3个基因分别进行敲除，结果显示SfAntp的缺失产生了胸节融合、胸足缺陷和头节与胸节之间有足状突起的突变表型;敲除SfUbx后，在解剖的突变体胚胎和孵化的突变体幼虫中都观察到第一腹节长出足状的突起结构;敲除SfAbd-B后，在突变体胚胎中出现了体节和附肢严重缺陷的表型，在孵化的1龄突变体幼虫表现出后腹部长出过剩足和体节融合的突变表型。另外任何一个基因的缺失均会导致胚胎高致死率。通过DNA测序发现SfAntp、SfUbx和SfAbd-B突变体的靶标位点都发生了不同程度的碱基移码突变，表明产生的突变表型确实是由SfAntp、SfUbx和SfAbd-B基因的敲除导致的。 本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术初步探究了Antp、Ubx和Abd-B基因在草地贪夜蛾附肢发育中的功能，结果表明SfAntp、SfUbx和SfAbd-B的敲除都导致草地贪夜蛾的足发育异常，并且产生了严重的胚胎致死效应。本实验对SfAntp、SfUbx和SfAbd-B功能的研究为解析其他鳞翅目昆虫附肢发育调控机理奠定了基础，也为草地贪夜蛾种群遗传调控致死遗传品系的构建提供了候选靶基因。
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