摘要
CYP51（Sterol14alpha-demethylase，甾醇14α-脱甲基酶）属于细胞色素P450超家族成员，广泛存在于动物、真菌和植物，在甾醇生物合成过程中发挥核心作用，同时也是油菜素类内脂(Brassinolide，BR)合成的关键酶。水稻CYP51亚家族由12个成员构成的，每个具体成员的确切功能未知。为探索CYP51基因家族成员的功能，本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术以粳稻日本晴品种获得OsCYP51突变体材料。通过对突变材料的鉴定、成熟期表型观察、籽粒表型分析，发现CRISPR/Cas9基因编辑突变类型多样，OsCYP51G3，OsCYP51H4，OsCYP51H6和OsCYP51H8基因的突变株系在株高、分蘖、叶夹角、籽粒大小、千粒重和花期方面均与对照存在显著差异。主要研究结果如下: 1、CRISPR/Cas9技术对OsCYP51家族成员基因编辑 利用CRISPR/Cas9技术对OsCYP51的10个基因进行双靶点编辑，获得186个转化植株，测序分析，获得39个编辑株系，成功编辑4个基因OsCYP51G3、OsCYP51H4、OsCYP51H6和OsCYP51H8，分别获得19，12，6和2个编辑株系。总编辑效率约为5.36％，单靶点编辑效率为3.43％，双靶点编辑效率为1.92％。 编辑类型大致分三类:简单双等位突变（一对同源染色体发生不同的突变事件）;纯合突变（一对同源染色体发生相同的突变事件）;杂合突变（一对同源染色体中只有1条发生突变事件）。OsCYP51G3基因编辑类型有纯合突变、简单双等位突变和杂合突变;OsCYP51H4基因编辑类型为纯合突变;OsCYP51H6和OsCYP51H8基因编辑类型纯合突变和杂合突变。 2、编辑株系株高、分蘖、叶夹角及花期等植株表型与对照相比存在差异 与对照相比，编辑株系株高均降低，降低幅度在3.5 cm-24.17 cm区间，OsCYP51G3，OsCYP51H4，OsCYP51H6和OsCYP51H8基因的编辑株系株高分别平均降低9.69％，16.90％，14.87％和6.21％，均达显著水平，叶夹角变小，花期延迟5-11天，分蘖数出现不同变化趋势。 不同编辑株系分蘖数的变化趋势不同，OsCYP51H8基因的编辑株系分蘖数减少，与对照相间差异达显著水平;基因OsCYP51G3，OsCYP51H4和OsCYP51H6的编辑株系分蘖数均有不同变化趋势，其中株系OsCYP51G3-17，OsCYP51H4-1和OsCYP51H6-6分蘖数分别增加18.31％，38.96％和35.21％，其他株系分蘖数减少。 3、编辑株系籽粒表型与对照相比存在差异 与对照相比，编辑株系粒宽和粒厚均减小，粒长和千粒重出现不同变化趋势。粒宽减小0.133 mm-0.317 mm之间，达显著水平，粒厚减小0.08 mm-0.137 mm区间，其中株系OsCYP51H4-6和OsCYP51H6-6差异达极显著水平。 与对照相比，不同基因编辑株系粒长变化存在差异，变长和变短的株系所占比例相当。OsCYP51H4和OsCYP51H6基因的编辑株系粒长分别平均增加1.71％和4.19％; OsCYP51H8基因编辑株系的粒长平均减小0.76％;多数OsCYP51G3基因编辑株系粒长变短，少数存在变长趋势。 与对照相比，编辑株系千粒重多数为降低趋势。OsCYP51G3，OsCYP51H4和OsCYP51H8基因的编辑株系千粒重分别降低7.38％，4.58％和9.88％。OsCYP51H6基因的编辑株系中OsCYP51H6-6千粒重降低为对照水平的82.02％，差异达极显著水平，其他株系千粒重增加，增加幅度是0.183 g-1.61 g，达到极显著差异。 本研究获得多种基因编辑材料，为水稻种质资源的创制及OsCYP51家族基因功能分析奠定基础。
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