摘要
斜纹夜蛾是一种杂食性的、暴食性的咀嚼式口器昆虫，而蚜虫是刺吸式口器昆虫。它们在全世界范围内都是为害作物广泛且严重的害虫。ERF转录因子调节植物的生长、发育以及对非生物和生物胁迫的抗性。但关于ERF转录因子在抗虫领域的相关研究却少有报道。目前，对咀嚼式口器和刺吸式口器害虫都兼具抗性的ERF转录因子尚未见报道。我们从中国大白菜中分离获得了一个ERF11-like基因，命名为BrERF11b，研究了它对斜纹夜蛾和桃蚜的抗性，并对其抗虫的分子机理进行了分析。 利用农杆菌介导的遗传转化获得了转BrERF11b基因本氏烟株系和三生烟株系。抗虫研究显示用转基因植物喂食的斜纹夜蛾幼虫与用对照野生型烟草喂食的相比总重量显著降低了28％-76％，而且用转基因植物株系KLine12叶片喂食的幼虫的成活率显著降低62.5％:与野生型相比，用转基因植物叶片喂食的的无翅蚜虫的繁殖率显著降低22.5％-63.4％，同时转基因植物株系显著降低蚜虫成活率46％-55％。这些结果表明BrERF11b基因能显著提高植物对斜纹夜蛾和桃蚜的抗性。 通过转录组测序、RT-qPCR验证及植物激素水平分析，我们发现转录因子BrERF11b通过激活JA合成酶类基因的转录，促进了JA的合成，同时激活了JA/ET信号通路，它们共同正调控蛋白酶抑制剂PI基因的表达，从而增强植株对咀嚼式口器害虫斜纹夜蛾的抗性。另一方面，BrERF11b正调控乙烯、水杨酸和茉莉酸三种信号分子的合成，激活Harpin诱导蛋白基因Hin1和MYB类转录因子基因NbMYB4的表达以及抑制与韧皮部胼胝质的沉积直接相关的胼胝质降解酶类β-1，3葡聚糖酶基因的表达。这些结果表明BrERF11b可能以一种与Harpins蛋白HrpNEa诱导抗虫相似的方式，正调控植物对蚜虫的抗性。 通过染色质免疫共沉淀结合高通量测序(ChIP-seq)、相关的的生物信息学分析、结合转录组测序分析以及EMSA验证，我们揭示了BrERF11b在本氏烟中结合的靶基因。类似于其它转录因子，BrERF11b偏爱结合于基因的转录起始位点附近。Motif分析结果显示BrERF11b主要是通过结合于类似GCC-box元件的保守DNA序列(VCGCCGCC)来调控下游基因的转录。我们根据峰顶序列设计了探针，通过EMSA验证了ChIP-Seq的结果，证明NbNIMIN2、NbTAF15b和NbERF4是转录因子BrERF11b的直接靶基因。NbNIMIN2和NbTAF15b这两个靶基因都与抗虫相关，是潜在的抗虫基因。 NbERF4不仅仅是BrERF11b的直接靶基因，且都属于ERF家族Ⅷa(B-1a)亚组，有EAR(ERF-associated amphiphilic repression)抑制基序。在JASPAR数据库中比对，BrERF11b的保守结合Motif序列与拟南芥AtERF4的Motif序列相似度最高，这意味着NbERF4也许能结合到自己的转录调控区，以正反馈或负反馈的方式调节自身基因的表达。通过病毒介导的基因沉默，我们研究了沉默NbERF4基因对本氏烟抗桃蚜的影响，发现沉默NbERF4基因会降低本氏烟对桃蚜的抗性。 总之，BrERF11b是第一个报道的能提高植物对咀嚼式昆虫和刺吸式昆虫抗性的ERF转录因子。BrERF11b基因有3个直接靶基因:NbNIMIN2、NbTAF15b和NbERF4。BrERF11b基因在烟草植物中可能通过直接抑制NbNIMIN2基因的表达来调控NPR1的活性，然后通过正调控JA合成酶类基因和蛋白酶抑制剂基因的表达，增强烟草植物对咀嚼式口器昆虫斜纹夜蛾的抗性;可能通过直接激活靶基因NbTAF15b和NbERF4的表达，然后通过上调Harpin诱导蛋白基因Hin1、MYB类转录因子基因NbMYB4和WRKY基因及下调胼胝质降解酶类β-1，3葡聚糖酶基因的表达，增强植物对刺吸式口器昆虫桃蚜的抗性。
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